Когато работите с високоефективна течна хроматография (HPLC), доброто калибриране е абсолютно необходимо, за да се осигурят надеждни и качествени резултати. Правилното калибриране на HPLC инструмент започва с изготвянето на подходящ стандарт за калибриране. В повечето случаи калибрирането всъщност изисква поредица от стандарти за увеличаване на концентрацията, за да се получи така наречената калибрационна крива. Това е начертана линия и свързано уравнение, което описва връзката между концентрацията на химичното вещество, за което се тества, и реакцията на HPLC детектора.
Определете химичното вещество, което искате да тествате за използване на HPLC ("аналита"). Например, може да пожелаете да тествате серия от безалкохолни напитки за съдържание на фруктоза, като в този случай фруктозата би била аналита.
Получава се количество от аналита с подходяща чистота. Обикновено чистотата трябва да бъде над 99% и аналитът трябва да бъде закупен от реномирана компания за доставка на химикали. В случай на фруктоза, например, бихте закупили чиста фруктоза от доставчик на химикали, а не от хранителен магазин.
Определете максималните и минималните очаквани концентрации на аналита в пробите, които възнамерявате да тествате на HPLC. В случай на безалкохолни напитки, бихте изследвали етикетите на напитките и бихте определили най-ниското и най-високото съдържание на фруктоза сред напитките, които ще тествате. Имайте предвид, че първоначалната проба (безалкохолната напитка) може да бъде разредена или манипулирана по друг начин по време на подготовката за анализ (в зависимост от използвания HPLC метод) и така концентрацията на аналита в пробите, действително инжектирани върху HPLC, може да бъде модифициран. Трябва да се има предвид концентрацията на аналита в пробите, извършена с HPLC.
Определете разтворителя, в който ще разтворите своя аналит, за да съставите стандарти за калибриране. Този разтворител трябва да може правилно да разтвори аналита в относително широк диапазон на концентрация (поне толкова висок, колкото в пробите, които възнамерявате да тествате). Освен това този разтворител в идеалния случай трябва да бъде доста подобен на "подвижната фаза:" разтворителят, използван за пренасяне на проби през HPLC инструмента.
Изчислете количеството на аналита, необходимо за приготвяне на "стандартен" разтвор на аналита. Това се установява чрез умножаване на необходимата концентрация на стандартния запас по желания обем. Концентрацията на аналита в този разтвор трябва да бъде поне 10% по-висока от най-високата очаквана концентрация на пробата. Ако най-високата очаквана концентрация на фруктоза в проба от безалкохолни напитки е 8 грама / 100 милилитра, тогава стандартният стандарт може да бъде направен до концентрация 10 грама фруктоза / 100 милилитра. Разумният обем е 500 милилитра, като по този начин ще са необходими 8/100 mL x 500 mL = 40 грама фруктоза.
Претеглете необходимото количество аналит до подходящо ниво на точност. Често е подходяща стойност на теглото в грамове с точност до един или два знака след десетичната запетая, но за някои методи може да е необходима по-голяма точност.
Претегленият аналит се прехвърля в мерителна колба с необходимия обем и се добавя желаният разтворител към маркировката за пълнене на колбата. Използването на мерителна колба (а не градуирана чаша например) увеличава точността на стандартната стойност на концентрацията на запаса. Уверете се, че целият аналит се прехвърля в колбата; използвайте малко от разтворителя, за да го измиете, ако е необходимо.
Направете серия от различни разреждания на основния стандарт, като прехвърлите известни обеми от основния стандарт в обемни колби, като използвате пипети за точно прехвърляне, след което добавите разтворител. Най-ниската стандартна концентрация трябва да бъде под най-ниската очаквана проба за анализ. В примера за безалкохолна напитка, ако най-ниската очаквана концентрация на фруктоза в проба е 2 грама / 100 мл, тогава може да се направи стандарт от 1 грам / 100 мл. Това ще бъде направено чрез десетократно разреждане на стандартния стандарт. Стандартната серия трябва да включва общо 5 или 6 концентрации, така че ще са необходими допълнителни разреждания, за да се получат стандарти от може би 3, 5 и 8 грама фруктоза / ml. Вече имате серия от стандартни решения, с които да калибрирате HPLC.