في البيولوجيا الجزيئية ، يمكن أن يكون اختيار المخزن المؤقت الجيد والتحضير لخطوات عزل الحمض النووي المختلفة الفرق بين الانتقال إلى تعبير البروتين أو فتح مجموعة أخرى من أدوات تحضير الطعام القصوى للبدء على. على الرغم من أهميتها الحاسمة ، إلا أن الوصفات العازلة غالبًا ما تكون مجرد وصفات مكتوبة بدون تفسير أو مبرر للمكونات المختلفة. أحد هذه العازلة هو الجلوكوز تريس- EDTA أو GTE العازلة.
ما هي GTE المستخدمة؟
يستخدم GTE لإعادة تعليق كريات الخلايا البكتيرية قبل فتح (كسر) الخلايا وحصاد DNA البلازميد بالداخل. غالبًا ما يُضاف الليزوزيم ، الذي يخفف من أغشية الخلايا ، جنبًا إلى جنب مع المخزن المؤقت لـ GTE. يعد تحقيق تعليق متجانس للخلايا الكاملة خلال هذه الخطوة بحيث يمكن لمحلول التحلل المضاف لاحقًا الوصول إلى جميع الخلايا هو المفتاح للحصول على عائدات جيدة من الحمض النووي. تم تصميم GTE للقيام بذلك مع توفير بيئة مستقرة للحمض النووي.
الجلوكوز للاسمولية
يضاف سكر الجلوكوز 50 ملي مولار إلى محلول GTE للحفاظ على الأسمولية حيث يكون تركيز الذائبة خارج الخلايا قريبًا من تركيزه داخل الخلايا. هذا يمنع تحلل الخلايا المبكرة ، والذي يمكن أن يتسبب في انخفاض إنتاجية الحمض النووي بسبب التجميع والتدهور. تساهم المكونات الأخرى للعازل أيضًا في الأسمولية للمحلول ، ولكن الجلوكوز ، كونه غير إلكتروليت ، يعد اختيارًا جيدًا لأنه لا يتداخل مع المخزن المؤقت للمحلول الخصائص.
تريس لاستقرار درجة الحموضة
Tris هو الاسم المختصر لـ tris (hydroxymethyl) aminomethane ، وهو محلول شائع جدًا لدرجة الحموضة. في حالة عازلة GTE ، يضاف الملح الحمضي (Tris-HCl) إلى المخزن المؤقت بتركيز 25 ملي مولار. هذا يحافظ على الرقم الهيدروجيني للمحلول عند 8.0 شبه الفسيولوجية ، ودرجة حموضة مثالية لمنع التحلل المائي الحمضي (تدهور) DNA البلازميد والتفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها لمكونات الخلية الأخرى.
EDTA يمنع تدهور الحمض النووي
EDTA ، أو حمض إيثيلين ديامينيترا أسيتيك ، يلتقط أو "يخلب" أيونات المعادن من المحلول ، مما يمنعها من المشاركة في التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها. في المخزن المؤقت GTE ، تتم إضافة EDTA عند 10 مللي متر. الغرض الأساسي منه هو المخزن المؤقت لتقريب الزنك والمغنيسيوم والكالسيوم الحر ، وبالتالي منع تدهور الحمض النووي من خلال مسارات معينة تتطلب تلك المعادن.
بعض النصائح الهامة
احتفظ بمخزن GTE باردًا واجعله بكميات صغيرة لمنع نمو البكتيريا غير المقصودة فيه. السكر والرقم الهيدروجيني المتحكم فيه يشكلان وسيط نمو كبير. استخدم دائمًا المياه النقية. يمكن أن تحتوي مياه الصنبور على فائض من الأيونات المعدنية من الأنابيب ، والتي يمكن أن تطغى على قدرة EDTA على الالتقاط. إذا كنت تشك في وجود RNA متداخل في عينتك ، أضف RNase A بمعدل 100 ميكروغرام لكل مليلتر إلى مخزن GTE للتخلص من المشكلة.