Електрофорез натрію додецилсульфат-поліакриламідний гель (SDS-PAGE) є біохімічним методом ідентифікації білків у розчині. Як проілюстровано Mathews та співавторами в "Біохімії", зразки білка спочатку завантажують у "лунки" або отвори на одному кінці блоку гелю з поліакриламідом. Потім на гель наносять електричне поле. SDS, доданий до завантажених зразків, заперечує природний заряд білків. З цієї причини лише молекулярна маса білка визначає швидкість міграції білків, коли вони рухаються через гель до позитивно зарядженого полюса, зазначає Bitesize Bio. Отже, декілька білків в одному зразку будуть відокремлюватися один від одного і мігрувати в різні положення.
Орієнтуйте гелеву фотографію. "Верх" - це місце розташування свердловин, куди спочатку додавали зразки. "Внизу" - це місце, де зразки мігрували в бік і найчастіше містять фронт барвника, який вказує на мігруючий фронт зразків. Ліворуч або праворуч повинен містити "маркер", який використовується як передбачуваний орієнтир молекулярної маси.
Позначте зразки для кожної смуги. Зверху зразки, додані до свердловин, будуть вертикально мігрувати у "смуги". Отже, всі смуги, видимі у вертикальній колонці, походять від одного зразка, завантаженого безпосередньо над ним. Використовуйте лінійку та перо, щоб нанести межі на смуги, якщо важко візуалізувати стовпці.
Позначте молекулярні розміри смуг у маркерній смузі. Комерційно доступні маркери мають зображення картини смуги, яку слід очікувати разом з молекулярними вагами кожної смуги. Смуги - це темні горизонтальні «смужки», які насправді є забарвленим білком, вбудованим у гель.
Намалюйте легкі горизонтальні лінії, що простягаються від кожної смужки маркера до протилежного краю гелю. Будьте обережні, щоб ці лінії були паралельними лункам і передній частині барвника. Ці рядки вказують, де білки з молекулярною масою, позначені кожною з маркерних смуг, будуть розташовані в кожній смузі. Наприклад, смуга на смузі 4, яка знаходиться трохи нижче лінії, витягнутої з 25-кілодонтону маркерна смуга припускає, що смуга 4 смуги становить майже, але не зовсім 25 кілодальтон в молекулярному відношенні вага.
Позначте кожну смугу в кожній смузі з її розрахунковою молекулярною масою. Використовуйте маркери як орієнтир та оцінюйте значення між розмірами маркерів.
Під гелевою фотографією складіть список «білків» для кожної смуги. Почніть із зазначення того, що відомо про кожну пробу, наприклад, її походження або умови. Потім перелічіть розрахункову молекулярну масу кожної смуги в смузі. Доріжки з однією смужкою вказують на те, що зразок містить лише один білок. Доріжки з кількома смугами вказують на наявність кількох білків. Діапазони, які працюють із фронтом міграції, менші, ніж пропонується найближчим маркером, і, ймовірно, не можуть бути передбачені, крім випадків, коли маркер вказує "менше, ніж".
У списку білків зверніть увагу на дивацтва. Помазаний зовнішній вигляд може свідчити про наявність занадто великої кількості білків або про в'язкість зразка, що впливає на його міграцію. краю смуги або досить великі в порівнянні з іншими смугами, тоді концентрація цього білка, ймовірно, занадто висока, і її слід розбавляти в майбутньому електрофорез. Сіруватий відтінок по всій смузі, темніший від фонового кольору гелю, вказує на невідмітні фрагменти білка.
Визначте ідентичність білків у кожній смузі. Хоча це робиться з використанням лише молекулярної маси, джерело кожної смуги, ймовірно, також вказуватиме підказки. Враховуйте, що за певних умов білки можуть підтримувати димер або тримерну асоціацію на гелі. Отже, один білок може з’являтися на гелі у вигляді трьох різних смуг. Навіть якщо білки неможливо ідентифікувати, відносна темрява смуг може означати концентрацію білків у розчині. Будь-які цікаві та невідомі білки можна виділити безпосередньо з оригінального гелю та відправити на ідентифікацію.
Речі, які вам знадобляться
- Фотографія гелю SDS-PAGE, забарвленого
- Ключ від використовуваного маркера молекулярної маси
- Лінійка
- Ручка