Kimyagerler, bileşik karışımlarını ayırmak için yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya HPLC kullanır. Genel olarak yöntem, bir numunenin bir veya daha fazla çözücü ile karıştığı bir kolona enjekte edilmesinden oluşur. Farklı bileşikler, kolona farklı derecelerde adsorbe edilir veya "yapışır"; ve çözücü bileşikleri kolondan iterken, karışımın bileşenlerinden biri kolondan önce çıkacaktır. Cihaz, bileşikleri kolondan çıkarken algılar ve x ekseninde tutma süresi ve y ekseninde detektörden gelen sinyal yoğunluğu ile bir grafikten oluşan bir kromatogram üretir. Bileşikler kolondan çıkarken kromatogramda “pikler” üretirler. Genel olarak, kromatogramdaki tepe noktaları ne kadar uzak ve dar olursa, çözünürlük o kadar yüksek olur. Bilim adamları, yeterli bir ayrımı temsil etmek için 1.0 veya daha yüksek bir çözünürlüğü düşünürler.
X ekseni değerlerinin her bir tepenin tabanında nerede olduğunu not ederek kromatogramdaki iki bitişik tepenin genişliklerini ölçün. X ekseni, genellikle saniye cinsinden ölçülen tutma süresini temsil eder. Böylece, bir tepe 15.1 saniyede başlayıp 18,5 saniyede bitiyorsa, genişliği (18,5 - 15,1) = 3,4 saniyedir.
Tepelerin maksimumlarının konumlarına karşılık gelen zamanı, yani x ekseni üzerindeki konumu not ederek tutma sürelerini belirleyin. Bu değer normalde 1. adımda genişliği hesaplamak için kullanılan iki değerin yaklaşık yarısı kadar olacaktır. Örneğin 1. adımda verilen örnek, yaklaşık 16.8 saniyede bir maksimum sergileyecektir.
İki tepe noktası arasındaki çözünürlüğü (R) şu şekilde hesaplayın:
R=\frac{RT_1-RT_2}{0.5(W_1+W_2)}
nerede RT1 ve RT2 tepe 1 ve 2'nin alıkonma sürelerini temsil eder ve W1 ve W2 tabanlarında alınan tepelerin genişliklerini temsil eder. 2. ve 3. adımlardan örneğe devam edildiğinde, bir tepe noktası 16.8 saniyelik bir tutma süresi ve 3.4 saniyelik bir genişlik sergiler. İkinci tepe noktası 3,6 saniye genişliğinde 21.4 saniyelik bir tutma süresi sergiliyorsa, çözünürlük şu şekilde olacaktır:
R=\frac{21.4-16.8}{0.5(3.4+3.6)}=1.3
İhtiyacınız Olan Şeyler
- HPLC kromatogramı
- Hesap makinesi
