วิธีการคำนวณความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

เมื่อพูดถึงการวัดความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ซึ่งมีขนาดเล็กกว่าเซลล์มาก นักจุลชีววิทยาจำเป็นต้องมีกลอุบาย และวิธีที่สะดวกที่สุดคือเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส วิธีนี้อาศัยความจริงที่ว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกชาร์จและเป็นทางเลือกที่มีราคาแพงกว่า วิธีการต่างๆ เช่น X-ray crystallography ซึ่งมีหน้าที่ในการค้นพบโครงสร้างเกลียวคู่ ของดีเอ็นเอ

เนื่องจากโมเลกุลของ DNA ถูกประจุ พวกมันจึงได้รับผลกระทบจากกระแสไฟฟ้า เมื่อคุณตั้งค่าพวกมันในเจลที่เป็นกลางและวางกระแสผ่านเจล โมเลกุลจะย้ายไปยังอิเล็กโทรดบวก (แอโนด) เนื่องจากโมเลกุลดีเอ็นเอที่มีขนาดต่างกันมีประจุเท่ากัน โมเลกุลที่เล็กกว่าเดินทางได้เร็วกว่า ดังนั้นกระบวนการนี้จึงแยกโมเลกุลออกเป็นแถบที่สามารถนำมาเปรียบเทียบกับตัวอย่างที่มีขนาดที่รู้จัก

เจลมักทำจาก agarose ซึ่งเป็นพอลิแซ็กคาไรด์ที่เมื่อให้ความร้อนในสารละลายบัฟเฟอร์จะทำให้เกิดเจลกึ่งแข็งและมีรูพรุนเล็กน้อย ที่ปลายด้านหนึ่ง เจลจะสร้างรอยเยื้องเล็กๆ ที่เรียกว่าหลุม ซึ่งผู้วิจัยวางตัวอย่างดีเอ็นเอไว้ภายใต้การศึกษา พร้อมกับตัวอย่างอ้างอิงที่ทราบความยาว ซึ่งเรียกว่าบันไดดีเอ็นเอ ความยาวของชิ้นส่วนแลดเดอร์ถูกกำหนดไว้ล่วงหน้าโดยวิธีอื่น เช่น ผลึกเอ็กซ์เรย์

เมื่อเจลจุ่มลงในสารละลายนำไฟฟ้าและใช้แรงดันไฟฟ้า ชิ้นส่วนจะเริ่มเคลื่อนผ่านเจล โดยชิ้นที่เล็กกว่าก่อนและชิ้นที่ใหญ่กว่าและช้ากว่า ในที่สุดพวกเขาก็สร้างตัวเองเป็นวงเหมือนสเปกตรัมตามขนาด

เมื่อสิ่งนี้เกิดขึ้น ผู้วิจัยจะปิดไฟ ใส่เจลด้วยสีย้อมติด DVA และตรวจสอบตัวอย่างภายใต้แสงอัลตราไวโอเลต โดยใช้บันไดเป็นข้อมูลอ้างอิง ผู้วิจัยสามารถกำหนดขนาดของแต่ละชิ้นส่วนในแถบที่มองเห็นได้ มองเห็นได้เฉพาะแถบเท่านั้น – ชิ้นส่วนดีเอ็นเอแต่ละชิ้นมีขนาดเล็กเกินกว่าจะมองเห็นได้

โอกาสไม่ใช่ทุกวงในตัวอย่างจะจับคู่กับแถบบนบันได ดังนั้นเพื่อกำหนดขนาดของชิ้นส่วนที่ไม่รู้จักเหล่านี้ นักวิทยาศาสตร์มักจะวาดกราฟ บนแกน x คือระยะทางที่แต่ละแถบเคลื่อนที่ในขั้นบันไดเป็นมิลลิเมตร ในขณะที่บนแกน y คือขนาดของแต่ละแถบ เมื่อจุดเชื่อมต่อกันด้วยเส้นโค้ง ขนาดของแถบใดๆ ก็สามารถประมาณจากเส้นโค้งได้หลังจากวัดระยะทางที่แถบนั้นเคลื่อนที่เป็นมิลลิเมตร