เป็นไปได้ที่จะโคลนสิ่งมีชีวิตทั้งหมด เช่น แกะดอลลี่ แต่การโคลนดีเอ็นเอนั้นแตกต่างกัน ใช้เทคนิคอณูชีววิทยาในการทำ สำเนาที่เหมือนกันของลำดับดีเอ็นเอหรือยีนเดี่ยว.
โดยใช้วิธีการทางพันธุวิศวกรรม ส่วนของรหัสพันธุกรรมดีเอ็นเอจะถูกระบุและแยกออก การโคลนดีเอ็นเอจากนั้นคัดลอก กรดนิวคลีอิค ลำดับในส่วน
สำเนาที่เหมือนกันที่ได้นั้นสามารถใช้สำหรับการวิจัยเพิ่มเติมหรือสำหรับการใช้งานด้านเทคโนโลยีชีวภาพ บ่อยครั้งที่ยีนที่ถูกคัดลอกเข้ารหัสโปรตีนที่สามารถเป็นส่วนหนึ่งของการรักษาพยาบาล เทคโนโลยีดีเอ็นเอ ได้แก่ การโคลนดีเอ็นเอ สนับสนุนความเข้าใจว่ายีนทำงานอย่างไร และรหัสพันธุกรรมของมนุษย์มีอิทธิพลต่อการทำงานของร่างกายอย่างไร
การโคลนดีเอ็นเอ: คำจำกัดความและภาพรวมกระบวนการ
การโคลนดีเอ็นเอเป็นกระบวนการทางอณูชีววิทยาในการทำสำเนาส่วนดีเอ็นเอที่เหมือนกันซึ่งอยู่ในโครโมโซมที่มีรหัสพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตขั้นสูง
กระบวนการสร้างปริมาณมากของ ลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย. เป้าหมายของการโคลนดีเอ็นเอคือการผลิตลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายด้วยตัวเองหรือเพื่อผลิตโปรตีนที่เข้ารหัสในลำดับเป้าหมาย
สองวิธีที่ใช้ในการโคลนดีเอ็นเอเรียกว่า พลาสมิดเวกเตอร์
และ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR). ใน พลาสมิดเวกเตอร์ วิธีตัดสาย DNA ด้วยวิธี เอนไซม์จำกัด เพื่อผลิตชิ้นส่วนดีเอ็นเอ และส่วนที่เป็นผลจะถูกแทรกเข้าไปในเวกเตอร์โคลนนิ่งที่เรียกว่าพลาสมิดเพื่อการทำซ้ำต่อไป พลาสมิดจะอยู่ในเซลล์แบคทีเรียที่ผลิตสำเนาดีเอ็นเอหรือโปรตีนที่เข้ารหัสใน วิธี PCR, ส่วนของสาย DNA ที่จะทำซ้ำจะถูกทำเครื่องหมายด้วยเอ็นไซม์ที่เรียกว่า ไพรเมอร์. เอนไซม์โพลีเมอเรสทำสำเนาส่วนที่ทำเครื่องหมายของสายดีเอ็นเอ วิธีนี้ไม่ใช้เอ็นไซม์จำกัดและสามารถผลิต DNA โคลนจากตัวอย่างขนาดเล็กได้ บางครั้งมีการใช้วิธีการทางเทคโนโลยีดีเอ็นเอสองวิธีร่วมกันเพื่อรวมคุณลักษณะที่ดีที่สุดของแต่ละวิธีในปฏิกิริยาโดยรวม
วิธีพลาสมิดเวกเตอร์
เวกเตอร์ของวิธีการอ้างอิงถึงพลาสมิดที่ใช้เก็บส่วน DNA เป้าหมายเพื่อทำการโคลน พลาสมิดเป็นเส้นกลมเล็กๆ DNA ที่ไม่ใช่โครโมโซม พบในสิ่งมีชีวิตหลายชนิดรวมทั้งแบคทีเรียและไวรัส
พลาสมิดของแบคทีเรียเป็นพาหะที่ใช้ในการแทรกเซ็กเมนต์ DNA เป้าหมายเข้าไปในเซลล์แบคทีเรียเพื่อการทำซ้ำเพิ่มเติม
การเลือกและแยก DNA เป้าหมาย: ก่อนที่กระบวนการโคลนดีเอ็นเอจะเริ่มขึ้น จะต้องมีการระบุลำดับดีเอ็นเอ โดยเฉพาะอย่างยิ่งจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของส่วนดีเอ็นเอ
ลำดับดีเอ็นเอดังกล่าวสามารถพบได้โดยใช้ DNA ที่ลอกแบบที่มีอยู่กับลำดับที่รู้จักหรือโดยการศึกษาโปรตีนที่ผลิตขึ้นโดยลำดับดีเอ็นเอเป้าหมาย เมื่อทราบลำดับแล้ว สามารถใช้เอนไซม์จำกัดที่เกี่ยวข้องได้
การตัด DNA เป้าหมายด้วยเอ็นไซม์จำกัด: เอ็นไซม์จำกัดถูกเลือกเพื่อค้นหารหัสดีเอ็นเอที่จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของลำดับเป้าหมาย
เมื่อเอ็นไซม์จำกัดพบลำดับรหัสพิเศษของคู่เบสที่เรียกว่าไซต์จำกัด พวกมัน ยึดตัวเองกับ DNA ที่ตำแหน่งนั้นและพันรอบโมเลกุล DNA โดยแยก สาระ ตอนนี้เซ็กเมนต์ DNA ที่ตัดซึ่งมีลำดับเป้าหมายพร้อมสำหรับการทำสำเนาแล้ว
การเลือกพลาสมิดเวกเตอร์และใส่ DNA เป้าหมาย: พลาสมิดที่เหมาะสมมีลำดับการเข้ารหัส DNA ที่เหมือนกันกับสาย DNA ซึ่ง DNA เป้าหมายถูกตัด สาย DNA แบบวงกลมของพลาสมิดถูกตัดด้วยเอ็นไซม์จำกัดแบบเดียวกับที่ใช้ในการตัด DNA เป้าหมาย
อา เอนไซม์ดีเอ็นเอ ไลเกส ใช้เพื่อส่งเสริมการเชื่อมโยงส่วน DNA และส่วนปลายของส่วน DNA เป้าหมายเชื่อมโยงกับส่วนปลายของพลาสมิด DNA ตอนนี้ DNA เป้าหมายเป็นส่วนหนึ่งของสาย DNA พลาสมิดแบบวงกลม
การใส่พลาสมิดเข้าไปในเซลล์แบคทีเรีย: เมื่อพลาสมิดมีลำดับดีเอ็นเอที่จะโคลน การโคลนจริงสามารถเกิดขึ้นได้โดยใช้กระบวนการที่เรียกว่า การเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรีย. พลาสมิดถูกแทรกเข้าไปในเซลล์แบคทีเรียเช่น E. coli และเซลล์ที่มีส่วน DNA ใหม่จะเริ่มสร้างสำเนาและโปรตีนที่เกี่ยวข้อง
ในการเปลี่ยนรูปของแบคทีเรีย เซลล์เจ้าบ้านและพลาสมิดจะถูกฟักร่วมกันที่อุณหภูมิร่างกายประมาณ 12 ชั่วโมง เซลล์ดูดซับพลาสมิดบางส่วนและปฏิบัติต่อพวกมันเหมือนพลาสมิด DNA ของพวกมันเอง
การเก็บเกี่ยว DNA และโปรตีนโคลน: พลาสมิดส่วนใหญ่ที่ใช้สำหรับการโคลนดีเอ็นเอมี ยีนดื้อยาปฏิชีวนะ รวมอยู่ใน DNA ของพวกเขา เมื่อเซลล์แบคทีเรียดูดซับพลาสมิดใหม่ พวกมันจะดื้อต่อยาปฏิชีวนะ
เมื่อวัฒนธรรมได้รับการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะ เฉพาะเซลล์ที่ดูดซับพลาสมิดใหม่เท่านั้นที่จะอยู่รอด ผลที่ได้คือการเพาะเลี้ยงเซลล์แบคทีเรียบริสุทธิ์ด้วย DNA ที่ลอกแบบมา จากนั้นจะสามารถเก็บเกี่ยว DNA นั้นหรือสามารถผลิตโปรตีนที่สอดคล้องกันได้
วิธี PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส)
PCR วิธีนี้ง่ายกว่าและคัดลอก DNA ที่มีอยู่แล้ว ไม่ต้องการการตัดด้วยเอ็นไซม์จำกัดหรือการแทรก พลาสมิดดีเอ็นเอ ลำดับ ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการโคลนตัวอย่าง DNA ที่มีสาย DNA ในจำนวนจำกัด แม้ว่าวิธีการนี้สามารถโคลน DNA ได้ แต่ก็ไม่สามารถใช้สำหรับการผลิตโปรตีนที่สอดคล้องกันได้
คลายเกลียวดีเอ็นเอ: ดีเอ็นเอในโครโมโซมถูกขดอย่างแน่นหนาในโครงสร้างเกลียวคู่ ให้ความร้อนแก่ DNA ถึง 96 องศาเซลเซียสในกระบวนการที่เรียกว่า การทำให้เสียสภาพ ทำให้โมเลกุลดีเอ็นเอคลายเกลียวและแยกออกเป็นสองเส้น การแยกนี้จำเป็นเนื่องจากสามารถโคลนดีเอ็นเอได้เพียงสายเดียวในคราวเดียว
การเลือกไพรเมอร์: เช่นเดียวกับการโคลนดีเอ็นเอของพลาสมิดเวกเตอร์ ลำดับดีเอ็นเอที่จะโคลนต้องได้รับการระบุโดยเน้นเป็นพิเศษที่จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของส่วนดีเอ็นเอ ไพรเมอร์คือเอ็นไซม์ที่ยึดติดกับลำดับรหัส DNA ที่เฉพาะเจาะจง และจะต้องเลือกพวกมันเพื่อทำเครื่องหมายส่วน DNA เป้าหมาย ไพรเมอร์ที่เหมาะสมจะยึดติดกับลำดับโมเลกุลดีเอ็นเอเพื่อทำเครื่องหมายจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของส่วนเป้าหมาย
การหลอมปฏิกิริยาเพื่อยึดไพรเมอร์: ทำให้ปฏิกิริยาเย็นลงเหลือประมาณ 55 องศาเซลเซียส เรียกว่า การหลอม. เมื่อปฏิกิริยาเย็นลง ไพรเมอร์จะถูกกระตุ้นและยึดติดกับสายดีเอ็นเอที่ปลายแต่ละด้านของส่วนดีเอ็นเอเป้าหมาย ไพรเมอร์ทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายเท่านั้น และไม่จำเป็นต้องตัดสายดีเอ็นเอ
การสร้างสำเนาของส่วน DNA เป้าหมายที่เหมือนกัน: ในกระบวนการที่เรียกว่า ส่วนขยายเอนไซม์ TAQ polymerase ที่ไวต่อความร้อนจะถูกเพิ่มเข้าไปในปฏิกิริยา ปฏิกิริยาจะถูกทำให้ร้อนถึง 72 องศาเซลเซียส กระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ เอ็นไซม์ DNA polymerase ที่ออกฤทธิ์จับกับไพรเมอร์และคัดลอกลำดับ DNA ระหว่างพวกมัน ขั้นตอนการหาลำดับดีเอ็นเอและโคลนนิ่งเริ่มต้นเสร็จสมบูรณ์
เพิ่มผลผลิตของ DNA โคลน: กระบวนการหลอมและการขยายเริ่มต้นจะสร้างสำเนาของส่วนของสายดีเอ็นเอที่มีอยู่ค่อนข้างน้อย เพื่อเพิ่มผลผลิตผ่านการจำลองดีเอ็นเอเพิ่มเติม ปฏิกิริยาจะถูกทำให้เย็นลงอีกครั้งเพื่อกระตุ้นไพรเมอร์อีกครั้งและปล่อยให้พวกมันจับกับสายดีเอ็นเออื่นๆ
จากนั้น การให้ความร้อนซ้ำกับปฏิกิริยาจะกระตุ้นเอนไซม์พอลิเมอเรสอีกครั้งและผลิตสำเนามากขึ้น รอบนี้สามารถทำซ้ำได้ 25 ถึง 30 ครั้ง
การใช้วิธีการโคลนนิ่ง DNA ของ Plasmid Vector และ PCR ร่วมกัน
วิธีพลาสมิดเวกเตอร์อาศัยการจัดหา DNA เริ่มต้นที่เพียงพอเพื่อตัดและสอดเข้าไปในพลาสมิด DNA ดั้งเดิมน้อยเกินไปส่งผลให้มีพลาสมิดน้อยลง และเริ่มสร้าง DNA โคลนได้ช้า
วิธี PCR สามารถผลิต DNA ได้ในปริมาณมากจากสาย DNA ดั้งเดิมเพียงไม่กี่เส้น แต่เนื่องจาก DNA ไม่ได้ฝังอยู่ในเซลล์แบคทีเรีย จึงไม่สามารถผลิตโปรตีนได้
ในการผลิตโปรตีนที่เข้ารหัสในชิ้นส่วน DNA เพื่อทำการโคลนจากตัวอย่าง DNA เริ่มต้นขนาดเล็ก ทั้งสองวิธีสามารถใช้ร่วมกันได้ เติมเต็มซึ่งกันและกัน ขั้นแรกใช้วิธี PCR เพื่อโคลน DNA จากตัวอย่างขนาดเล็กและผลิตสำเนาจำนวนมาก
จากนั้นจึงใช้ผลิตภัณฑ์ PCR ด้วยวิธีพลาสมิดเวคเตอร์เพื่อปลูกฝัง DNA ที่ผลิตขึ้นในเซลล์แบคทีเรียที่จะผลิตโปรตีนที่ต้องการ
ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพ
อณูชีววิทยาใช้การโคลนยีนและการจำลองแบบดีเอ็นเอเพื่อวัตถุประสงค์ทางการแพทย์และเชิงพาณิชย์ แบคทีเรียที่มีลำดับดีเอ็นเอโคลนนั้นใช้ในการผลิตยาและทดแทนสารที่ผู้ที่มีความผิดปกติทางพันธุกรรมไม่สามารถผลิตเองได้
การใช้งานทั่วไป ได้แก่ :
- ยีนสำหรับ อินซูลินของมนุษย์ ถูกโคลนในแบคทีเรียที่ผลิตอินซูลินที่ใช้โดยผู้ป่วยโรคเบาหวาน
- ตัวกระตุ้นเนื้อเยื่อ plasminogen ผลิตจาก DNA ที่โคลนและใช้เพื่อช่วยในการ ป้องกันลิ่มเลือด.
- ฮอร์โมนการเจริญเติบโตของมนุษย์ สามารถผลิตและบริหารงานให้กับผู้ที่ไม่สามารถผลิตเองได้
เทคโนโลยีชีวภาพยังใช้การโคลนยีนในการเกษตรเพื่อสร้างลักษณะใหม่ในพืชและสัตว์หรือปรับปรุงลักษณะที่มีอยู่ เมื่อมีการโคลนยีนจำนวนมากขึ้น จำนวนการใช้ที่เป็นไปได้จะเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ
ตัวอย่างการโคลนดีเอ็นเอเพื่อการวิจัย
โมเลกุลดีเอ็นเอประกอบขึ้นเป็นเศษเล็กเศษน้อยของวัสดุในเซลล์ที่มีชีวิต และเป็นการยากที่จะแยกแยะอิทธิพลของยีนจำนวนมาก วิธีการโคลนดีเอ็นเอส่งลำดับดีเอ็นเอเฉพาะจำนวนมากสำหรับการศึกษา และดีเอ็นเอก็ผลิตโปรตีนเช่นเดียวกับที่ทำในเซลล์ต้นกำเนิด การโคลนดีเอ็นเอทำให้สามารถศึกษาการทำงานของยีนต่างๆ แยกกันได้
การวิจัยทั่วไปและการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอรวมถึงการตรวจสอบ:
- หน้าที่ของยีน
- การกลายพันธุ์ของยีน
- การแสดงออกของยีน
- ผลิตภัณฑ์ยีน
- ข้อบกพร่องทางพันธุกรรม
เมื่อมีการโคลนลำดับดีเอ็นเอมากขึ้น การค้นหาและโคลนลำดับเพิ่มเติมจะง่ายขึ้น สามารถใช้เซ็กเมนต์ DNA ที่โคลนที่มีอยู่เพื่อกำหนดว่าเซ็กเมนต์ใหม่ตรงกับเซกเมนต์เก่าหรือไม่ และส่วนใดที่แตกต่างกัน การระบุลำดับ DNA เป้าหมายนั้นรวดเร็วและแม่นยำยิ่งขึ้น
ตัวอย่างของการโคลนดีเอ็นเอสำหรับยีนบำบัด
ใน ยีนบำบัดยีนโคลนจะถูกนำเสนอต่อเซลล์ของสิ่งมีชีวิตที่ยีนตามธรรมชาติได้รับความเสียหาย ยีนสำคัญที่สร้างโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการทำงานของสิ่งมีชีวิตที่เฉพาะเจาะจงอาจถูกกลายพันธุ์ เปลี่ยนแปลงโดยการฉายรังสี หรือได้รับผลกระทบจากไวรัส
เมื่อยีนทำงานไม่ถูกต้อง สารสำคัญจะหายไปจากเซลล์ ยีนบำบัดพยายามที่จะ tries แทนที่ยีนด้วยรุ่นโคลนที่จะผลิตสารที่ต้องการ.
การบำบัดด้วยยีนยังคงเป็นการทดลอง และมีผู้ป่วยเพียงไม่กี่รายที่รักษาให้หายขาดโดยใช้เทคนิคนี้ ปัญหาอยู่ที่การระบุยีนตัวเดียวที่รับผิดชอบต่อสภาวะทางการแพทย์และส่งสำเนายีนจำนวนมากไปยังเซลล์ที่ถูกต้อง เนื่องจากการโคลนดีเอ็นเอเป็นที่แพร่หลายมากขึ้น การบำบัดด้วยยีนจึงถูกนำมาใช้ในหลายสถานการณ์
แอปพลิเคชันที่ประสบความสำเร็จล่าสุดได้รวม:
- โรคพาร์กินสัน: การใช้ไวรัสเป็นพาหะ ยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคพาร์กินสันถูกฉีดเข้าไปในสมองส่วนกลางของผู้ป่วย ผู้ป่วยได้รับทักษะยนต์ที่ดีขึ้นโดยไม่มีผลข้างเคียงใดๆ
- การขาดสารอะดีโนซีนดีอะมิเนส (ADA): ความผิดปกติของภูมิคุ้มกันทางพันธุกรรมได้รับการรักษาโดยการกำจัดเซลล์ต้นกำเนิดจากเลือดของผู้ป่วยและใส่ยีน ADA ผู้ป่วยสามารถผลิต ADA ของตนเองได้อย่างน้อยบางส่วน
- ฮีโมฟีเลีย: ผู้ที่เป็นโรคฮีโมฟีเลียไม่ได้ผลิตโปรตีนเฉพาะที่ช่วยให้ลิ่มเลือด ยีนสำหรับการผลิตโปรตีนที่หายไปตัวหนึ่งถูกแทรกเข้าไปในเซลล์ตับของผู้ป่วย ผู้ป่วยผลิตโปรตีนและมีเลือดออกลดลง
การบำบัดด้วยยีนเป็นหนึ่งในการประยุกต์ใช้การโคลนดีเอ็นเอที่มีแนวโน้มมากที่สุด แต่การใช้งานใหม่อื่นๆ มีแนวโน้มที่จะเพิ่มจำนวนขึ้นเมื่อมีการศึกษาลำดับดีเอ็นเอมากขึ้นและกำหนดหน้าที่ของพวกมัน การโคลนดีเอ็นเอส่งวัตถุดิบสำหรับพันธุวิศวกรรมในปริมาณที่จำเป็น
เมื่อทราบบทบาทของยีนและการทำงานที่เหมาะสมของยีนสามารถมั่นใจได้ด้วยการแทนที่ยีนที่บกพร่อง ยีน โรคเรื้อรังมากมาย และแม้แต่มะเร็งสามารถโจมตีและรักษาในระดับพันธุกรรมได้โดยใช้DNA เทคโนโลยี
เนื้อหาที่เกี่ยวข้อง:
- ลักษณะอาณานิคมของ E.Coli (Escherichia Coli)
- RNA: ความหมาย ฟังก์ชัน โครงสร้าง
