เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส เป็นเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ใช้กันทั่วไปพร้อมการใช้งานจริงมากมายรวมถึงลายนิ้วมือ DNA และการจัดลำดับจีโนม กระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับการแยก ดีเอ็นเอ ชิ้นส่วนที่ใช้กระแสไฟฟ้าขณะติดตามอัตราการเคลื่อนที่ของโมเลกุลผ่านเจลกรอง
การเพิ่มสีย้อมติดตามสีน้ำเงินหรือสีส้มลงในตัวอย่าง DNA ที่ไม่มีสี ช่วยให้คุณดูตัวอย่างและรับข้อมูลเกี่ยวกับการเคลื่อนที่ของโมเลกุลดีเอ็นเอในระหว่างการอิเล็กโตรโฟรีซิส การระบุจะขึ้นอยู่กับขนาดของแถบดีเอ็นเอบนเจลหลังจากการอพยพของโมเลกุล
วิธีการทำงานของเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส
เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ดึงชิ้นส่วนดีเอ็นเอผ่านเจลโดยใช้กระแสไฟฟ้าเพื่อแยกและระบุโมเลกุลดีเอ็นเอตามขนาดและประจุไฟฟ้า เจลมักทำด้วย ผงอากาโรส — โพลีแซคคาไรด์ที่สกัดจาก สาหร่าย.
Agarose ถูกเติมลงในสารละลายบัฟเฟอร์ของน้ำและเกลือ และส่วนผสมจะถูกทำให้ร้อนและเย็นลงเพื่อสร้างเจลที่มีรูพรุนซึ่งจะทำหน้าที่เป็นเมทริกซ์การกรองระหว่างขั้นตอนอิเล็กโตรโฟรีซิส จากนั้นเจลจะถูกวางในหน่วยอิเล็กโตรโฟรีซิสและเคลือบด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ที่นำไฟฟ้า ไฟฟ้า.
สารละลายที่มี DNA และสีย้อมติดจะถูกปิเปตลงในหลุมเล็กๆ ในเจล ซึ่งต้องทำระหว่างการเตรียมเจล
สีย้อมช่วยคุณดูตัวอย่างได้ชัดเจน ที่คุณเพิ่มลงในหลุมเจลที่อยู่ใกล้กับขั้วลบของหน่วยอิเล็กโตรโฟรีซิสอิเล็กโทรดบวกตั้งอยู่ที่ปลายฝั่งตรงข้าม มาตรฐานที่รู้จักของชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกวางไว้ในหลุมแรกซึ่งจะสร้างบันไดของแถบดีเอ็นเอเพื่อวัตถุประสงค์ในการเปรียบเทียบและระบุตัวตน
กระดูกสันหลังฟอสเฟตของโมเลกุลดีเอ็นเอทำให้ดีเอ็นเอมีประจุลบ ตรงกันข้ามดึงดูดดังนั้นโมเลกุลของ DNA จะถูกดึงดูดไปยังอิเล็กโทรดบวกและเริ่มเคลื่อนที่หรือ "โยกย้าย" เมื่อเปิดกระแสไฟฟ้า
ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดเล็กกว่าจะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่าชิ้นส่วนขนาดใหญ่ เนื่องจากพบการต้านทานน้อยลงเมื่อเคลื่อนผ่านเมทริกซ์ที่มีรูพรุนของเจล ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีขนาดใกล้เคียงกันสร้างแถบดีเอ็นเอในเจล
กำลังโหลดวัตถุประสงค์และความสำคัญของสีย้อม
ดีเอ็นเอไม่มีสีจึงเติม ติดตามสีย้อม เพื่อเป็นตัวอย่างช่วยคุณ กำหนดอัตราการเคลื่อนไหว ของโมเลกุลโปรตีนขนาดต่างๆ ในเจลระหว่างอิเล็กโตรโฟรีซิส ตัวอย่างการใส่สีย้อมที่เคลื่อนที่ไปกับตัวอย่าง DNA ได้แก่ โบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน และ ไซลีน ไซยานอล
สีย้อมที่เลือกไม่ควรทำปฏิกิริยาหรือเปลี่ยนแปลง DNA โบรโมฟีนอลสีน้ำเงินเป็นสีย้อมที่ใช้ในการติดตามสาย DNA ที่มีขนาดเล็กกว่าซึ่งมีคู่เบสประมาณ 400 คู่ ในขณะที่ไซลีนไซยานอลจะดีกว่าสำหรับสาย DNA ขนาดใหญ่ที่มีเบสมากถึง 8,000 คู่ สีย้อมที่เลือกไม่ควรทำปฏิกิริยาหรือเปลี่ยนแปลง DNA
บทบาทของกลีเซอรอลใน Agarose Gel Electrophoresis
เมื่อเตรียมตัวอย่าง DNA ของคุณสำหรับ อิเล็กโตรโฟรีซิสคุณจะต้องเติมกลีเซอรอลและน้ำพร้อมกับสีย้อม กลีเซอรอลเป็นสารน้ำเชื่อมที่หนักและให้ความหนาแน่นมากขึ้นกับตัวอย่าง DNA ก่อนที่จะใส่ลงในหลุมที่ปลายด้านหนึ่งของแผ่นเจล
หากไม่มีกลีเซอรอล ตัวอย่าง DNA จะกระจายตัวแทนที่จะจมและก่อตัวเป็นชั้นในบ่อน้ำอย่างที่ควรจะทำเพื่อสร้างบันไดของ DNA
การติดตามสีย้อมใน SDS PAGE
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) เป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการแยกโปรตีนและกรดอะมิโนซึ่งมีขนาดเล็กและซับซ้อนกว่าโมเลกุลดีเอ็นเอเชิงเส้น ใช้โพลีอะคริลาไมด์ (เจล SDS PAGE) แทนเจลอะกาโรสสำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส
โบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน (BPB) ถูกเติมลงในบัฟเฟอร์ตัวอย่างเป็น a ติดตามสีย้อม ที่เคลื่อนที่ไปในทิศทางเดียวกันในการแยกโปรตีนและแบ่งเขตผู้นำ
บทบาทของสีย้อมพันธะดีเอ็นเอ
สีย้อมติดดีเอ็นเอ เช่น สีส้ม สามารถเติมเอทิเดียมโบรไมด์ลงในเจลหรือบัฟเฟอร์อิเล็กโตรโฟรีซิสได้ ตามชื่อที่แนะนำ สีย้อมยึดติดกับโมเลกุลดีเอ็นเอ
ต้องใช้ความระมัดระวังเป็นอย่างยิ่งในการจัดการกับสีย้อมที่ทำให้เกิดการกลายพันธุ์เพราะสามารถจับกับ DNA ในเซลล์ผิวหนังได้ ต่างจากสีย้อมติดเอทิเดียม โบรไมด์ เรืองแสง ใต้สดใส แสงยูวีทำให้แถบดีเอ็นเอมองเห็นได้
