ในอณูชีววิทยา การเลือกบัฟเฟอร์ที่ดีและการเตรียมการสำหรับขั้นตอนการแยก DNA ที่แตกต่างกันสามารถทำได้ can ความแตกต่างระหว่างการเปลี่ยนไปสู่การแสดงออกของโปรตีนหรือการเปิดชุด maxi-prep อื่นเพื่อเริ่มต้น เกิน. แม้จะมีความสำคัญอย่างยิ่ง สูตรบัฟเฟอร์มักจะเป็นเพียงสูตรที่เขียนโดยไม่มีคำอธิบายหรือเหตุผลสำหรับส่วนประกอบต่างๆ หนึ่งในบัฟเฟอร์ดังกล่าวคือ กลูโคส-ทริส-EDTA หรือบัฟเฟอร์ GTE
GTE ใช้สำหรับอะไร?
GTE ใช้เพื่อระงับเม็ดเซลล์แบคทีเรียก่อนที่จะสลาย (เปิดออก) เซลล์และเก็บเกี่ยว DNA พลาสมิดภายใน ไลโซไซม์ ซึ่งทำให้เยื่อหุ้มเซลล์นุ่มขึ้น มักถูกเติมร่วมกับบัฟเฟอร์ GTE การได้รับสารแขวนลอยที่เป็นเนื้อเดียวกันของทั้งเซลล์ในขั้นตอนนี้ เพื่อให้สารละลาย lysis ที่เพิ่มเข้ามาในภายหลังสามารถไปยังเซลล์ทั้งหมดได้เป็นกุญแจสำคัญในการได้ผลผลิต DNA ที่ดี GTE ได้รับการออกแบบมาเพื่อทำสิ่งนี้ในขณะที่ยังให้สภาพแวดล้อมที่มั่นคงสำหรับ DNA
กลูโคสสำหรับออสโมลาริตี
น้ำตาลกลูโคส 50 มิลลิโมลาร์ (มิลลิโมลาร์) ถูกเติมลงในบัฟเฟอร์ GTE เพื่อรักษาระดับออสโมลาริตี โดยที่ความเข้มข้นของตัวถูกละลายภายนอกเซลล์ใกล้เคียงกับที่อยู่ภายในเซลล์ ซึ่งจะป้องกันการแตกตัวของเซลล์ก่อนวัยอันควร ซึ่งอาจทำให้ผลผลิต DNA ลดลงเนื่องจากการรวมตัวกันและการเสื่อมสภาพ ส่วนประกอบอื่นๆ ของบัฟเฟอร์ยังมีส่วนทำให้เกิดออสโมลาริตีของสารละลาย แต่กลูโคส ไม่ใช่อิเล็กโทรไลต์เป็นทางเลือกที่ดีเพราะไม่รบกวนบัฟเฟอร์ของสารละลาย คุณสมบัติ.
Tris for pH Stability
ทริสเป็นชื่อย่อของทริส (ไฮดรอกซีเมทิล) อะมิโนมีเทน ซึ่งเป็นบัฟเฟอร์ pH ทั่วไป ในกรณีของบัฟเฟอร์ GTE เกลือที่เป็นกรด (Tris-HCl) จะถูกเติมลงในบัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 25 มิลลิโมลาร์ ซึ่งจะคงค่า pH ของสารละลายไว้ที่เกือบ 8.0 ทางสรีรวิทยา ซึ่งเป็น pH ที่เหมาะสำหรับการป้องกันกรดไฮโดรไลซิส (การย่อยสลาย) ของ DNA พลาสมิดและปฏิกิริยาข้างเคียงที่ไม่ต้องการของส่วนประกอบอื่นๆ ของเซลล์
EDTA ป้องกันการเสื่อมสภาพของ DNA
EDTA หรือกรดเอทิลีนไดเอมีนเตตระอะซิติกจับหรือ "คีเลต" ไอออนของโลหะออกจากสารละลาย เพื่อป้องกันไม่ให้เกิดปฏิกิริยาข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ ในบัฟเฟอร์ GTE จะเพิ่ม EDTA ที่ 10mM จุดประสงค์หลักของมันคือในบัฟเฟอร์เพื่อรวบรวมสังกะสี แมกนีเซียม และแคลเซียมอิสระ เพื่อป้องกันการสลายตัวของ DNA โดยวิถีทางบางอย่างที่ต้องใช้โลหะเหล่านั้น
เคล็ดลับสำคัญบางประการ
เก็บบัฟเฟอร์ GTE ของคุณให้เย็นและปรุงในปริมาณเล็กน้อยเพื่อป้องกันการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่ไม่ได้ตั้งใจ น้ำตาลและค่า pH ที่ควบคุมทำให้อาหารเจริญเติบโตได้ดี ใช้น้ำบริสุทธิ์เสมอ น้ำประปาอาจมีไอออนโลหะมากเกินไปจากท่อ ซึ่งสามารถครอบงำความสามารถของ EDTA ในการดักจับ หากคุณสงสัยว่ามี RNA ที่รบกวนในตัวอย่างของคุณ ให้เพิ่ม RNase A ที่ 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรในบัฟเฟอร์ GTE ของคุณเพื่อขจัดปัญหา