ข้อดีของการใช้เอนไซม์ปลายเหนียว

การโคลนโมเลกุลเป็นวิธีการทางเทคโนโลยีชีวภาพทั่วไปที่นักเรียนและนักวิจัยทุกคนควรคุ้นเคย การโคลนโมเลกุลโดยใช้เอ็นไซม์ชนิดหนึ่งที่เรียกว่าเอ็นไซม์จำกัดเพื่อตัด DNA ของมนุษย์ออกเป็นชิ้นๆ ซึ่งสามารถแทรกเข้าไปในพลาสมิด DNA ของเซลล์แบคทีเรียได้ เอ็นไซม์จำกัดจะตัด DNA ที่มีเกลียวสองเส้นออกครึ่งหนึ่ง การตัดอาจส่งผลให้ปลายเหนียวหรือปลายทู่ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับเอ็นไซม์จำกัด ปลายเหนียวมีประโยชน์มากกว่าในการโคลนโมเลกุลเพราะช่วยให้แน่ใจว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอของมนุษย์ถูกแทรกเข้าไปในพลาสมิดในทิศทางที่ถูกต้อง กระบวนการ ligation หรือการรวมชิ้นส่วนของ DNA ต้องการ DNA น้อยลงเมื่อ DNA มีปลายเหนียว สุดท้ายนี้ เอ็นไซม์ควบคุมปลายหนืดหลายตัวสามารถทำให้เกิดปลายหนึบเหมือนกัน แม้ว่าแต่ละเอ็นไซม์จะรับรู้ลำดับการจำกัดที่ต่างกัน สิ่งนี้จะเพิ่มโอกาสที่บริเวณ DNA ที่คุณสนใจจะถูกตัดออกด้วยเอ็นไซม์ที่เหนียวเหนอะหนะ

เอ็นไซม์จำกัดคือเอ็นไซม์ที่ตัดการรับรู้ลำดับเฉพาะบน DNA ที่มีเกลียวคู่และตัด DNA ออกครึ่งหนึ่งในลำดับนั้น ลำดับที่รู้จักเรียกว่าไซต์จำกัด เอ็นไซม์จำกัดเรียกว่าเอ็นโดนิวคลีเอสเพราะพวกมันตัด DNA แบบสองสายซึ่งเป็นลักษณะปกติของ DNA ที่ตำแหน่งที่อยู่ระหว่างปลายดีเอ็นเอ มีเอ็นไซม์จำกัดมากกว่า 90 ชนิด แต่ละคนรู้จักไซต์ข้อจำกัดที่แตกต่างกัน เอ็นไซม์การจำกัดสามารถแยกตำแหน่งการจำกัดตามลำดับได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าไซต์อื่นๆ ที่พวกเขาไม่รู้จักถึง 5,000 เท่า

เอนไซม์จำกัดมาในสองประเภททั่วไป พวกเขาตัด DNA เป็นปลายเหนียวหรือปลายทู่ ปลายเหนียวมีส่วนสั้นของนิวคลีโอไทด์ ซึ่งเป็นหน่วยการสร้างของ DNA ที่ไม่มีการจับคู่ บริเวณที่ไม่มีการจับคู่นี้เรียกว่าส่วนที่ยื่นออกมา กล่าวกันว่าระยะยื่นมีความเหนียวเนื่องจากต้องการและจะจับคู่กับปลายเหนียวอีกอันที่มีลำดับระยะยื่นเสริม ปลายที่เหนียวเหนอะหนะเหมือนฝาแฝดที่หายไปนานพยายามกอดกันแน่นเมื่อพบกัน ในทางกลับกัน ปลายทู่นั้นไม่เหนียวเหนอะเพราะนิวคลีโอไทด์ทั้งหมดถูกจับคู่ระหว่าง DNA สองสายแล้ว ข้อดีของปลายเหนียวคือชิ้นส่วนของ DNA ของมนุษย์สามารถเข้ากับพลาสมิดของแบคทีเรียได้ในทิศทางเดียวเท่านั้น ในทางตรงกันข้าม ถ้าทั้ง DNA ของมนุษย์และพลาสมิดของแบคทีเรียมีปลายทู่ DNA ของมนุษย์สามารถสอดแทรกแบบตัวต่อตัวหรือตัวต่อตัวในพลาสมิดได้

แม้ว่า DNA ที่มีปลายเป็นแท่งจะหากันได้ง่ายขึ้นเพราะ "ความเหนียว" ของพวกมัน แต่ปลายที่เหนียวหรือปลายทู่ก็ไม่สามารถหลอมรวมกันเป็น DNA ที่ต่อเนื่องกันได้ การก่อตัวของ DNA ที่ต่อเนื่องกันซึ่งเชื่อมโยงกันอย่างสมบูรณ์ต้องใช้เอนไซม์ที่เรียกว่า ligase Ligases เชื่อมต่อกระดูกสันหลังของนิวคลีโอไทด์ที่ปลายเหนียวหรือปลายทู่ ส่งผลให้เกิดสายโซ่นิวคลีโอไทด์อย่างต่อเนื่อง เนื่องจากปลายเหนียวจะพบกันเร็วขึ้นเนื่องจากการดึงดูดซึ่งกันและกัน กระบวนการของ ligation จึงต้องการ DNA ของมนุษย์น้อยกว่าและ DNA พลาสมิดน้อยกว่า ปลายทู่ของ DNA และพลาสมิดมักจะพบกันน้อยกว่า ดังนั้น ligation ของปลายทู่จึงต้องใส่ DNA เข้าไปในหลอดทดลองมากขึ้น

ไซต์จำกัดตั้งอยู่ทั่วจีโนมของสิ่งมีชีวิต แต่ไม่ได้เว้นระยะห่างเท่าๆ กัน ในพลาสมิด พวกมันสามารถถูกออกแบบให้อยู่ติดกันได้ นักวิทยาศาสตร์ที่ต้องการตัดชิ้นส่วนของ DNA ของมนุษย์ออกจากจีโนมมนุษย์จะต้องค้นหาไซต์จำกัดที่อยู่ด้านหน้าและด้านหลังของบริเวณของชิ้นส่วนดังกล่าว นอกเหนือจากการทำให้มั่นใจว่าชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกแทรกไปในทิศทางที่ถูกต้องแล้ว เอ็นไซม์ปลายเหนียวที่แตกต่างกันสามารถสร้างปลายเหนียวเหมือนกันได้ แม้ว่าจะรับรู้ลำดับการจำกัดที่แตกต่างกัน ตัวอย่างเช่น BamHI, BglII และ Sau3A มีลำดับการจดจำต่างกัน แต่สร้างจุดสิ้นสุดแบบติดหนึบ GATC เดียวกัน สิ่งนี้จะเพิ่มความเป็นไปได้ที่จะมีไซต์จำกัดการสิ้นสุดที่เหนียวแน่นซึ่งขนาบข้างยีนมนุษย์ที่คุณสนใจ