ตามเว็บไซต์ BioWeb ของมหาวิทยาลัยวิสคอนซิน PCR ไพรเมอร์คือโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ระยะสั้น (โดยปกติอยู่ระหว่าง 18 ยาวถึง 25 เบส) ใช้ในการขยายขอบเขตเฉพาะของ DNA ในเทคนิคทางอณูชีววิทยาที่เรียกว่าปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (พีซีอาร์) จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ทั้งแบบไปข้างหน้าและแบบย้อนกลับ ซึ่งออกแบบมาเพื่อให้เป็นส่วนเสริมแบบย้อนกลับของสายดีเอ็นเอ เพื่อขนาบข้างและผูกมัดกับบริเวณดีเอ็นเอที่ต้องการ เมื่อนักวิทยาศาสตร์ต้องการทำการวิจัยเกี่ยวกับยีนหรือภูมิภาคของ DNA ที่เฉพาะเจาะจง ก่อนอื่นพวกเขาจำเป็นต้องทำ PCR เพื่อให้ได้พื้นที่เป้าหมายที่เพียงพอสำหรับการทำงานด้วย การออกแบบลำดับไพรเมอร์สำหรับพื้นที่ที่สนใจอาจมีความจำเป็นหากไม่มีอยู่แล้วผ่านการวิจัยที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้หรือโดยวิธีการเชิงพาณิชย์
รับลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนหรือบริเวณ DNA ที่สนใจ และตัดสินใจว่าคุณต้องการขยายส่วนย่อยนานแค่ไหน ไพรเมอร์เดินหน้าและถอยหลังถูกออกแบบมาเพื่อผูกที่จุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของชิ้นส่วนที่ต้องการ โดยทั่วไป วิธี PCR ทั่วไปจะใช้ไพรเมอร์ที่ขนาบข้างบริเวณระหว่าง 100 ถึง 1,000 คู่เบสยาว ในขณะที่วิธี PCR แบบเรียลไทม์จะใช้ชิ้นส่วนที่มีความยาวประมาณ 50 ถึง 200 คู่เบส
ตัดสินใจว่าคุณต้องการให้ไพรเมอร์อยู่ตรงไหนในลำดับ ตัวอย่างเช่น คุณอาจต้องการตำแหน่งใกล้กับจุดสิ้นสุดของลำดับ 5' หรือ 3' หรือตรงกลาง หากต้องการ ให้กำหนดตำแหน่งของไพรเมอร์เพื่อขยายช่วงอินตรอน
ออกแบบไพรเมอร์ให้มีความยาว 18 ถึง 24 เบส วินเซนต์ อาร์. Prezioso, Ph. D. จาก Brinkmann Instruments Inc. ชี้ให้เห็นว่าความยาวนี้ยาวพอที่จะจำเพาะเจาะจงอย่างมากสำหรับบริเวณ DNA ที่ต้องการ แต่สั้นพอที่จะผูก (หลอม) ได้ง่าย อุณหภูมิหลอมเหลวของไพรเมอร์ (Tm) ควรอยู่ระหว่าง 55 ถึง 80 องศาเซลเซียส ต่ำพอที่จะทำให้การหลอมเหลวสมบูรณ์ที่หรือสูงกว่า 90 องศาเซลเซียส แต่สูงพอที่จะทำให้หลอมได้ เนื้อหา GC (เปอร์เซ็นต์ของ Gs และ Cs ในลำดับ) ควรอยู่ระหว่าง 40 ถึง 60 เปอร์เซ็นต์ จุดสิ้นสุด 3' ของลำดับไพรเมอร์ควรลงท้ายด้วย C หรือ G (เรียกว่าแคลมป์ GC) เพื่อส่งเสริมการยึดเกาะ เนื่องจาก G และ C นิวคลีโอไทด์มีพันธะที่แข็งแรงกว่า อย่างไรก็ตาม หลีกเลี่ยงการมี Gs หรือ C สามตัวหรือมากกว่าในห้าเบสสุดท้ายของลำดับ
หลีกเลี่ยงการวิ่งของเบสเดียวตั้งแต่สี่ตัวขึ้นไป (เช่น ACCCC...) หรือได-นิวคลีโอไทด์ซ้ำสี่ครั้งหรือมากกว่า (เช่น ATATATAT...) เพราะอาจทำให้เกิดการผิดพลาดได้ ออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่มีความคล้ายคลึงกันภายในไพรเมอร์ (มากกว่าสามฐานที่เสริมภายในหนึ่ง ไพรเมอร์เอง) หรือความคล้ายคลึงระหว่างไพรเมอร์ (โดยไพรเมอร์ไปข้างหน้าและข้างหลังมีส่วนเสริม ลำดับ) สิ่งนี้สามารถทำให้เกิด self-dimers หรือ primer-dimers โดยที่ไพรเมอร์จับกับตัวเองแทนที่จะจับกับลำดับดีเอ็นเอที่ต้องการ
ใช้แหล่งข้อมูลออนไลน์และเว็บไซต์ที่ช่วยในการออกแบบไพรเมอร์หรือช่วยตรวจสอบลำดับของไพรเมอร์สำหรับการเสริมตัวเองหรือศักยภาพในการสร้างโครงสร้างรองเช่นกิ๊บติดผม เว็บไซต์ออกแบบไพรเมอร์บางแห่ง ได้แก่ Primer3 ของสถาบันเทคโนโลยีแมสซาชูเซตส์, Primer-Blast ของ National Center for Biotechnology Information และ OligoAnalyzer ของ Integrated DNA Technologies
