DNA-kloning: definition, process, exempel

Det är möjligt att klona hela organismer som Dolly fåren, men DNA-kloning är annorlunda. Den använder molekylärbiologiska tekniker för att skapa identiska kopior av DNA-sekvenser eller enstaka gener.

Med hjälp av gentekniska metoder identifieras och isoleras segment av DNA-genetiska koden. DNA-kloning kopierar sedan nukleinsyra sekvenser i segmenten.

De resulterande identiska kopiorna kan användas för vidare forskning eller för bioteknikapplikationer. Genen som kopieras kodar ofta för ett protein som kan ingå i medicinska behandlingar. DNA-teknik inklusive DNA-kloning stöder förståelsen för hur gener fungerar och hur människors genetiska kod påverkar kroppens funktion.

DNA-kloning är den molekylära biologiprocessen för att göra identiska kopior av DNA-segment som ligger i kromosomerna som innehåller den genetiska koden för avancerade organismer.

Processen genererar stora mängder av mål-DNA-sekvenser. Målet med DNA-kloning är att producera mål-DNA-sekvenserna själva eller att producera proteinerna som kodas i målsekvenserna.

De två metoderna som används vid DNA-kloning kallas plasmidvektor och polymeraskedjereaktion (PCR). I plasmidvektor DNA-strängar skärs med restriktionsenzymer för att producera DNA-fragment, och de resulterande segmenten infogas i kloningsvektorer som kallas plasmider för ytterligare duplicering. Plasmiderna placeras i bakterieceller som sedan producerar DNA-kopior eller kodade proteiner.

I PCR-metod, är segmentet av DNA-strängar som ska dupliceras markerat med anropade enzymer grundfärger. Ett polymerasenzym gör kopior av den markerade delen av DNA-strängen. Denna metod använder inte restriktionsenzymer och kan producera klonat DNA från små prover. Ibland används de två DNA-teknologimetoderna tillsammans för att införliva de bästa funktionerna hos var och en i en övergripande reaktion.

Metodens vektor avser plasmiden som används för att hålla mål-DNA-segmentet som ska klonas. Plasmider är små cirkulära strängar av icke-kromosomalt DNA finns i många organismer inklusive bakterier och virus.

Bakteriella plasmider är vektorn som används för insättning av mål-DNA-segmentet i bakterieceller för ytterligare duplicering.

Välja och isolera mål-DNA: t: Innan DNA-kloningsprocessen kan börja måste DNA-sekvenserna identifieras, särskilt början och ändarna på DNA-segmenten.

Sådana DNA-sekvenser kan hittas genom att använda befintligt klonat DNA med kända sekvenser eller genom att studera det protein som produceras av mål-DNA-sekvensen. När väl sekvensen är känd kan motsvarande restriktionsenzymer användas.

Skärning av mål-DNA med restriktionsenzymer: Restriktionsenzymer väljs för att leta efter DNA-koden i början och slutet av målsekvenserna.

När restriktionsenzymerna hittar en speciell kodad sekvens av baspar som kallas restriktionsställen, de fäster sig vid DNA på den platsen och lindar sig runt DNA-molekylen och bryter strå. De skurna DNA-segmenten som innehåller målsekvensen är nu tillgängliga för duplicering.

Välja plasmidvektorn och infoga mål-DNA: t: En lämplig plasmid innehåller idealiskt samma DNA-kodande sekvenser som DNA-strängen från vilken mål-DNA skars. Den cirkulära DNA-strängen i plasmiden skärs med samma restriktionsenzymer som användes för att skära mål-DNA.

A DNA-ligasenzym används för att främja DNA-segmentlänkning, och ändarna av mål-DNA-segmentet kopplas upp med de skurna ändarna av plasmid-DNA. Mål-DNA: t utgör nu en del av den cirkulära plasmid-DNA-strängen.

Insättning av plasmiden i en bakteriecell: När plasmiden innehåller den DNA-sekvens som ska klonas, kan den faktiska kloningen äga rum med en process som kallas bakteriell transformation. Plasmiderna införs i en bakteriecell såsom E. coli, och cellerna med de nya DNA-segmenten börjar producera kopior och motsvarande proteiner.

Vid bakteriell transformation inkuberas värdcellerna och plasmiderna tillsammans vid kroppstemperatur i cirka 12 timmar. Cellerna absorberar en del av plasmiderna och behandlar dem som sitt eget plasmid-DNA.

Skörd av klonat DNA och proteiner: De flesta plasmider som används för DNA-kloning har gener mot antibiotikaresistens införlivas i deras DNA. Eftersom bakteriecellerna absorberar de nya plasmiderna blir de resistenta mot antibiotika.

När kulturen behandlas med antibiotika överlever bara de celler som har absorberat de nya plasmiderna. Resultatet är en ren kultur av bakterieceller med klonat DNA. Det DNA kan sedan skördas eller motsvarande protein kan produceras.

De PCR metoden är enklare och kopierar befintligt DNA på plats. Det kräver inte skärning med restriktionsenzymer eller insättning plasmidDNA sekvenser. Detta gör det särskilt lämpligt för kloning av DNA-prover med ett begränsat antal DNA-strängar. Medan metoden kan klona DNA kan den inte användas för produktion av motsvarande protein.

Ta bort DNA-trådarna: DNA i kromosomer är tätt lindad i en dubbel helixstruktur. Uppvärmning av DNA till 96 grader Celsius i en process som kallas denaturering gör att DNA-molekylen rullas upp och separeras i två strängar. Denna separation krävs eftersom endast en enda DNA-sträng kan klonas åt gången.

Välja primers: Som med plasmidvektor-DNA-kloning måste DNA-sekvenserna som ska klonas identifieras med särskild tonvikt på början och ändarna av DNA-segmenten. Primers är enzymer som fäster vid specifika DNA-kodsekvenser, och de måste väljas för att markera mål-DNA-segmenten. Rätt primers kommer att fästa vid DNA-molekylsekvenserna för att markera början och ändarna av målsegmenten.

Glödgning av reaktionen för att binda primers: Kylning av reaktionen ner till cirka 55 grader Celsius kallas glödgning. När reaktionen svalnar aktiveras primrarna och fäster sig vid DNA-strängen i varje ände av ett mål-DNA-segment. Primers fungerar endast som markörer, och DNA-strängen behöver inte skäras.

Producerar identiska kopior av mål-DNA-segmentet: I en process som kallas förlängningtillsätts det värmekänsliga TAQ-polymerasenzymet till reaktionen. Reaktionen upphettas sedan till 72 grader Celsius, vilket aktiverar enzymet. Det aktiva DNA-polymerasenzymet binder till primrarna och kopierar DNA-sekvensen mellan dem. Den initiala DNA-sekvenserings- och kloningsprocessen är klar.

Ökning av utbytet av klonat DNA: Den initiala glödgnings- och förlängningsprocessen skapar relativt få kopior av de tillgängliga DNA-strängsegmenten. För att öka utbytet genom ytterligare DNA-replikering kyls reaktionen igen för att återaktivera primrarna och låta dem bindas till andra DNA-strängar.

Därefter aktiverar reaktionsuppvärmningen igen polymerasenzymet och fler kopior produceras. Denna cykel kan upprepas 25 till 30 gånger.

Plasmidvektormetoden är beroende av en riklig initial tillförsel av DNA för att skära och infoga i plasmider. För lite original-DNA resulterar i färre plasmider och en långsam start av klonad DNA-produktion.

PCR-metoden kan producera en stor mängd DNA från få original-DNA-strängar, men eftersom DNA inte implanteras i en bakteriecell är det inte möjligt att producera protein.

För att producera det protein som kodas i DNA-fragmenten som ska klonas från ett litet initialt DNA-prov kan de två metoderna användas tillsammans och de kan ge varandra komplimanger. Först används PCR-metoden för att klona DNA från ett litet prov och producera många kopior.

Därefter används PCR-produkterna med plasmidvektormetoden för att implantera det producerade DNA: t i bakterieceller som producerar det önskade proteinet.

Molekylärbiologi använder genkloning och DNA-replikering för medicinska och kommersiella ändamål. Bakterierna med klonade DNA-sekvenser används för att producera läkemedel och ersätta ämnen som människor med genetiska störningar inte kan producera själva.

Typiska användningsområden inkluderar:

• Genen för humant insulin klonas i bakterier som sedan producerar det insulin som används av diabetiker.
• Vävnadsplasminogenaktivator produceras från klonat DNA och används för att hjälpa till förhindra blodproppar.
• Mänskligt tillväxthormon kan produceras och administreras till människor som inte kan producera det själva.

Bioteknik använder också genkloning i jordbruket för att skapa nya egenskaper hos växter och djur eller förbättra befintliga egenskaper. När fler gener klonas ökar antalet möjliga användningar exponentiellt.

DNA-molekyler utgör en liten del av materialet i en levande cell, och det är svårt att isolera påverkan från de många generna. DNA-kloningsmetoderna levererar stora mängder av en specifik DNA-sekvens för studier, och DNA producerar proteiner precis som i originalcellen. DNA-kloning gör det möjligt att studera denna operation för olika gener isolerat.

Typiska applikationer för forskning och DNA-teknik inkluderar att undersöka:

• Genens funktion.
• Mutationer av en gen.
• Genexpression.
• Genprodukter.
• Genetiska defekter.

När fler DNA-sekvenser klonas är det lättare att hitta och klona ytterligare sekvenser. De befintliga klonade DNA-segmenten kan användas för att avgöra om ett nytt segment matchar det gamla och vilka delar som skiljer sig åt. Att identifiera en mål-DNA-sekvens är då snabbare och mer exakt.

I genterapi, presenteras en klonad gen för cellerna i en organism vars naturliga gen är skadad. En vital gen som producerar ett protein som krävs för en specifik organismfunktion kan muteras, förändras genom strålning eller påverkas av virus.

När genen inte fungerar ordentligt saknas en viktig substans i cellen. Genterapi försöker ersätt genen med en klonad version som producerar det nödvändiga ämnet.

Genterapi är fortfarande experimentell och få patienter har botats med tekniken. Problemen ligger i att identifiera den enda genen som är ansvarig för ett medicinskt tillstånd och leverera många kopior av genen till rätt celler. Eftersom DNA-kloning har blivit mer utbredd har genterapi tillämpats i flera specifika situationer.

Nyligen framgångsrika ansökningar har inkluderat:

• Parkinsons sjukdom: Genom att använda ett virus som en vektor injicerades en Parkinsons sjukdomsrelaterad gen i patientens mellanhjärnor. Patienterna upplevde förbättrad motorik utan några negativa biverkningar.
• Adenosindeaminas (ADA) -brist: En genetisk immunsjukdom behandlades genom att avlägsna patienternas blodstamceller och införa ADA-genen. Patienterna kunde producera åtminstone en del av sin egen ADA som ett resultat.
• Hemofili: Människor med hemofili producerar inte specifika proteiner som hjälper blodpropp. En gen för produktion av ett av de saknade proteinerna sattes in i levercellerna hos patienter. Patienterna producerade proteinet och blödningsincidenterna minskade.

Genterapi är en av de mest lovande tillämpningarna av DNA-kloning, men andra nya användningar kommer sannolikt att sprida sig när fler DNA-sekvenser studeras och deras funktion bestäms. DNA-kloning levererar råvaran för genteknik i de kvantiteter som behövs.

När generens roll är känd och deras korrekta funktion kan säkerställas genom att ersätta defekt gener, många kroniska sjukdomar och till och med cancer kan attackeras och behandlas på genetisk nivå med hjälp av DNA teknologi.

Relaterat innehåll:

• Koloniegenskaper hos E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: definition, funktion, struktur