Gelelektrofores är en vanligt förekommande laboratorieteknik med många praktiska tillämpningar inklusive DNA-fingeravtryck och genomsekvensering. Processen innebär separering DNA fragment med hjälp av en elektrisk ström medan spårningen av molekylär rörelse genom en filtreringsgel.
Genom att lägga till blå eller orange spårfärgämne i färglösa DNA-prover kan du se ditt prov och få information om hur DNA-molekyler rör sig under elektrofores. Identifiering baseras på storleken på DNA-band på gelén efter migrering av molekyler.
Hur gelelektrofores fungerar
Gelelektrofores drar DNA-fragment genom en gel med en elektrisk ström för att isolera och identifiera DNA-molekyler efter storlek och elektrisk laddning. Gelén tillverkas ofta med agarospulver - en polysackarid extraherad från tång.
Agaros tillsätts till en buffertlösning av vatten och salt och blandningen upphettas och kyls för att göra en porös gel som fungerar som en filtreringsmatris under elektroforesproceduren. Gelén placeras sedan i en elektroforesenhet och täcks med buffertlösning som leder elektricitet.
Lösningar som innehåller DNA och laddningsfärger pipetteras i små brunnar i gelén som måste göras under gelberedningen. Färgämnenhjälpa digse provet tydligt som du lägger till gelbrunnarna i närheten av den negativa elektroden i elektroforesenheten.
En positiv elektrod är placerad i motsatt ände. En känd standard av DNA-fragment placeras i den första källan som skapar en stege av DNA-band för jämförelse- och identifieringsändamål.
Fosfatstommen i DNA-molekyler ger DNA en negativ laddning. Motsatser lockar så följaktligen dras DNA-molekyler till den positiva elektroden och börjar röra sig, eller "migrera", när en elektrisk ström slås på.
DNA-fragment med mindre storlek reser snabbare än större fragment eftersom de stöter på mindre motstånd när de migrerar genom gelens porösa matris. DNA-fragment med liknande storlek bildar band av DNA i gelén.
Laddar färgämnes syfte och betydelse
DNA är färglöst, så att lägga till spårningsfärger till ett prov hjälper dig bestäm hastigheten proteinmolekyler av olika storlek i gelén under elektrofores. Exempel på laddningsfärger som rör sig med DNA-provet inkluderar bromfenolblå och xylencyanol.
Det valda färgämnet bör inte vara reaktivt eller ändra DNA. Bromfenolblått är ett färgämne som används för att spåra mindre DNA-strängar som innehåller cirka 400 baspar, medan xylencyanol är bättre för större DNA-strängar med upp till 8000 baspar. Det valda färgämnet bör inte vara reaktivt eller ändra DNA.
Roll av glycerol i elektrogares av agarosgel
När du förbereder ditt DNA-prov för elektrofores, måste du tillsätta glycerol och vatten tillsammans med laddningsfärger. Glycerol är en tung, sirapaktig substans som ger DNA-provet mer densitet innan den sätts in i brunnarna i ena änden av gelarket.
Utan glycerol skulle DNA-provet spridas i stället för att sjunka och bilda ett lager i brunnen som det skulle göra för att bilda en DNA-stege.
Tracking Dye i SDS PAGE
Natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS PAGE) är en teknik som är lämplig för att separera proteiner och aminosyror, som är mindre och mer komplexa än linjära DNA-molekyler. Polyakrylamid (SDS PAGE gel) används istället för agarosgel för elektrofores.
Bromfenolblått (BPB) tillsätts till provbufferten som en spårfärg som rör sig i samma riktning för att separera proteiner och avgränsar deras framkant.
Rollen för DNA-bindande färgämne
DNA-bindande färgämne såsom orange färgad etidiumbromid kan sättas till gel eller till elektroforesbufferten. Som namnet antyder fäster färgämnet på DNA-molekylen.
Stor försiktighet måste iakttas vid hantering av detta mutagena färgämne eftersom det kan binda till DNA i hudceller. Till skillnad från spårfärger, etidiumbromid lysrör ljust under UV ljus, vilket gör DNA-banden synliga.