Enligt University of Wisconsin's BioWeb-webbplats är en PCR-primer en kort, syntetisk oligonukleotid (vanligtvis mellan 18 25 baser långa) används för att amplifiera specifika regioner av DNA i en molekylärbiologisk teknik som kallas polymeraskedjereaktion (PCR). Både en framåtriktad och omvänd primer behövs, utformad för att vara omvänd komplement till DNA-strängen, för att flankera och binda till den önskade DNA-regionen. När forskare vill utföra forskning på en specifik gen eller region av DNA måste de först utföra PCR för att förvärva tillräckligt med målregionen att arbeta med. Designa primersekvenser för regionen av intresse kan vara nödvändigt om de inte redan är tillgängliga genom tidigare publicerad forskning eller på kommersiellt sätt.
Få nukleotidsekvensen för genen eller DNA-regionen av intresse och bestäm hur länge ett fragment du vill förstärka. Primer framåt och bakåt är utformad för att binda i början och i slutet av det önskade fragmentet. Vanligtvis använder konventionella PCR-metoder primers som flankerar en region mellan 100 och 1000 baspar långa, medan PCR-metoder i realtid använder fragment som är cirka 50 till 200 baspar långa.
Bestäm var i sekvensen du vill att grundfärgen ska ligga. Du kanske till exempel vill ha platsen nära 5 'eller 3' änden av sekvensen eller i mitten. Om så önskas, ange placeringen av primrarna för att sträcka sig över ett intron.
Designa grundfärger som är 18 till 24 baser långa. Vincent R. Prezioso, Ph. D., från Brinkmann Instruments Inc., föreslår att denna längd är tillräckligt lång för att vara extremt specifik för den önskade DNA-regionen, men tillräckligt kort för att binda (glödga) lätt. Primersmältningstemperaturen (Tm) bör vara mellan 55 och 80 grader Celsius, tillräckligt låg för att möjliggöra fullständig smältning vid eller över 90 grader Celsius, men tillräckligt hög för att möjliggöra glödgning. GC-innehållet (procent av Gs och Cs i sekvensen) bör vara mellan 40 och 60 procent. 3'-änden av primersekvensen bör sluta i en C eller en G (kallad GC-klämma) för att främja bindning, eftersom G och C nukleotider har starkare bindningar, men undvik att ha tre eller flera Gs eller Cs i de sista fem baserna i sekvensen.
Undvik att ha körningar på fyra eller fler av en bas (som ACCCC ...) eller fyra eller flera di-nukleotidupprepningar (som ATATATAT ...) eftersom de kan orsaka felpriming. Designa primers utan någon primer-homologi (mer än tre baser som kompletterar inom den primer själv) eller inter-primer homologi (där den främre och bakre primern har kompletterande sekvenser). Detta kan orsaka självdimerer eller primerdimerer, där primrarna binder till sig själva istället för att binda till önskad DNA-sekvens.
Använd online-resurser och webbplatser som hjälper till med primerdesign eller hjälper till att kontrollera primersekvenser för självkomplementaritet eller potentialen att skapa sekundära strukturer som hårnålar. Vissa webbplatser för primerdesign inkluderar Massachusetts Institute of Technology Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast och Integrated DNA Technologies 'OligoAnalyzer.
