Nackdelarna med Western Blotting

Western blotting är en av de vanligaste procedurerna i biokemiska laboratorier. I grund och botten separerar det proteiner från ett prov efter storlek och testar sedan med antikroppar för att avgöra om ett visst protein är närvarande. Det är användbart inte bara i forskning utan också i medicinska eller diagnostiska laboratorier; tester för både HIV och Lyme-sjukdom, till exempel, involverar ett enzym-länkat immunosorbentanalys (ELISA) -test, följt av en Western blot om ELISA testar positivt. Trots sin popularitet har Western blotting dock flera nackdelar.

Klassiska Western-blotting är icke-kvantitativa. Med andra ord, medan de kan berätta för forskare om ett visst protein är närvarande, gör de det inte möjligt att kvantifiera hur mycket av proteinet som finns. Vissa bioteknikföretag säljer nu kit som gör det möjligt för forskare eller laboratorietekniker att kvantifiera mängden protein närvarande med en standardkurva - men det fungerar bara om det finns rena prover av samma protein tillgängligt. Dessutom kan molekylvikten för ett protein bara uppskattas med Western blotting, snarare än bestämmas exakt som med masspektrometri.

En Western blot kan endast utföras om primära antikroppar mot proteinet av intresse finns tillgängliga. Medan antikroppar för många olika proteiner är tillgängliga från bioteknikföretag är de inte billiga; om primära antikroppar inte är tillgängliga för ett visst protein kommer det inte att vara möjligt att utföra en Western blot som letar efter det specifika proteinet. Dessutom kanske forskare vill avgöra om ett protein har modifierats på något sätt - om det har fosforylerats (hade en fosfatgruppen fäst vid den), till exempel - och med Western blot-tekniken behöver de antikroppar som är specifika för den modifierade protein.

Det kan vara utmanande att utföra en Western blot korrekt och få bra resultat, så personalen måste vara välutbildad. I detta som i mycket annat är erfarenhet kanske den bästa handledaren; även för en erfaren tekniker är en Western blot tidskrävande. Gelelektroforesdelen av experimentet tar till exempel typiskt från en till två timmar att köra. Andra uppgifter kan naturligtvis utföras medan gelén är igång, men experimentet tar fortfarande ganska lång tid att få resultat.

Antikroppar kan ibland uppvisa en viss bindning utanför målet, vilket kan ge sämre resultat. Dessutom, med Western blotting, använder du en antikropp mot ett specifikt protein, så dina resultat kommer bara att berätta om det proteinet var närvarande. Högupplöst masspektrometri avslöjar däremot alla proteiner som finns i ett prov, och till skillnad från klassisk Western-blotting är det kvantitativt. Det är naturligtvis viktigt att komma ihåg att masspektrometri är mycket dyrare och också mer tekniskt utmanande att använda jämfört med Western blotting.