Spektrofotometri är ett ovärderligt verktyg inom kemi och biologi. Grundidén är enkel: olika ämnen absorberar ljus / elektromagnetisk strålning bättre vid vissa våglängder än andra. Det är därför som vissa material är genomskinliga medan andra till exempel är färgade. När du lyser ljus med en given våglängd genom en lösning, desto högre koncentration desto mer ljus absorberar den. För att beräkna koncentrationen måste du jämföra din avläsning med avläsningar för standarder för känd koncentration. Förfarandet nedan är ett ganska generiskt förfarande skrivet med ett kemilaboratorium i åtanke, men det kan också ändras för andra inställningar.
Som alltid när du arbetar i ett laboratorium, ta på dig skyddsglasögon, handskar och långärmad kappa för att säkerställa din egen säkerhet.
Pressa gummilampan för att tömma den från luft och placera den ovanpå din graderade pipett och låt glödlampan slappna av så att den suger upp vatten i pipetten. Ta sedan bort glödlampan och sätt på toppen av pipetten med fingret. detta förseglar pipetten så att lösningen inuti inte rinner ut förrän fingret tas bort. Lyft fingerkanten något så att en liten lösning rinner ut ur pipetten tills du når önskad volym. Öva med lite vatten och en bägare för att få en känsla för hur den graderade pipetten fungerar. Länken under avsnittet Resurser har ett filmklipp som visar hur du använder en pipett om du aldrig har arbetat med en förut.
Märk 5 provrör som standard 1-5. Du kan märka dem med hjälp av maskeringstejp och en penna eller med en torrmarkeringsmarkör.
Välj fem koncentrationer för dina standarder. Du vill att standardkoncentrationerna ska separeras från varandra med ungefär samma intervall - t.ex. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar etc. - och i ungefär samma intervall som vad du förväntar dig att ditt okända kommer att vara. För närvarande använder du följande fem koncentrationer, men kom ihåg att du måste ändra dessa när du utför ditt eget experiment:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Ta sedan 1 molar standardlösning och tillsätt följande mängder i provrör 1-5. Kom ihåg att dessa belopp beräknas med hjälp av koncentrationerna ovan, så du kan behöva ändra dem efter behov när du utför ditt eget experiment.
Standard 1: 0,8 milliliter Standard 2: 1,6 milliliter Standard 3: 2,4 milliliter Standard 4: 3,2 milliliter Standard 5: 4 milliliter
Skölj den graderade pipetten och överför sedan följande mängder avjoniserat vatten:
Standard 1: 7,2 milliliter Standard 2: 6,4 milliliter Standard 3: 5,6 milliliter Standard 4: 4,8 milliliter Standard 5: 4,0 milliliter
I grund och botten är tanken att öka mängden lösning i varje rör upp till 8 milliliter.
Täck på var och en av standardrören med parafilm och vänd dem för att blanda.
Markera ytterligare fem provrör som "Okänd 1-5." Lägg till samma mängder av din okända eller testlösning till var och en som du använde med 1 molär lösning för standarderna. Med andra ord, okänd 1 kommer att innehålla 0,8 ml testlösning och 7,2 ml vatten, okänt 2 kommer att innehålla 1,6 milliliter testlösning och 6,4 milliliter vatten, och så vidare.
Täcka var och en av de okända med parafilm och vänd försiktigt för att blanda.
Slå på spektrofotometern och låt den värmas upp. Hur lång tid som krävs beror på modellen och tillverkaren.
Ställ in våglängden på spektrofotometern. Våglängden beror på typen av kemikalie i ditt experiment. För närvarande, anta 500 nm, men kom ihåg att du kommer att behöva ändra detta för olika experiment.
Kalibrera din spektrofotometer. Kalibreringsproceduren varierar beroende på vilken enhet du använder. För Spectronic 20, en vanlig modell i laboratorier, kommer du först att justera maskinen så att den läser "0 procent T" när ingen kyvett är laddad, justera den så att den läser "100% T" när en tom kyvett som endast innehåller avjoniserat vatten är lastad. Dessa procedurer kan variera beroende på vilken typ av maskin du använder, så se tillverkarens instruktioner för mer information.
Efter att maskinen har kalibrerats, ta standard 1 provrör och häll innehållet i en ren kyvett tills de når fyllningslinjen. Torka av kyvetten med en kimwipe för att ta bort fingeravtryck eller annan smuts. Sätt in kyvetten i spektrofotometern och registrera avläsningen "% T".
Upprepa denna procedur för alla 10 proverna. VAR FÖRSIKTIG att rengöra kyvetten mellan proverna så att dina resultat är så exakta som möjligt.
Ta resultaten för dina standarder och ange dem i ett kalkylblad / diagramprogram som Excel eller OpenOffice.
Dela kalkylprogrammet med 100 procent av var och en av "% T" -värdena för standarderna och ta sedan loggen för resultatet. Denna beräkning ger dig absorbansen. Om du matar in formeln gör kalkylprogrammet beräkningen åt dig.
Exempel: Om% T är 50,6 skulle formeln du matar in i kalkylprogrammet vara följande:
logg (100 / 50,6)
Kalkylprogrammet gör aritmetiken.
Gör detsamma för alla fem okända / experimentella värden.
Grafera absorbansvärdena för alla fem standarder, med koncentration på x-axeln och absorbansen på y-axeln. Använd kalkylprogrammet och anpassa en linjär ekvation till den här grafen. Ekvationen kommer att ha formen y = mx + b. De flesta kalkylprogram har en linjär regressionsfunktion. Se användarhandboken för ditt kalkylprogram för information om hur du använder linjär regressionsfunktion.
Ta ekvationen för linjen som passar bäst från ditt kalkylprogram och lös den för y genom att subtrahera b från båda sidor och dela båda sidor med m. Resultatet ser ut som följande:
(y - b) / m = x
där b och m är värden som hittas i ditt kalkylprogram.
Kontrollera dina absorbansvärden för okända och välj tre som faller inom samma intervall som standarderna. Använd dessa tre absorbansvärden för dina återstående beräkningar. Om alla fem faller inom samma intervall som standarderna kan du använda alla fem istället, men du måste använda minst tre.
Anslut vart och ett av de tre absorbansvärdena till din ekvation istället för y. Kom ihåg att din ekvation var i följande form:
(y - b) / m = x
Så du vill ansluta absorbansvärdet för varje okänt till ekvationen istället för y och sedan beräkna x. Du kan använda kalkylprogrammet för att göra denna beräkning åt dig och göra det snabbare. Du har nu beräknat koncentrationen av kemikalien av intresse i tre av dina utspädda okända. Den ursprungliga lösningen späddes ut för att förbereda dessa okända, så du måste nu arbeta bakåt och beräkna koncentrationen av den ursprungliga lösningen baserat på utspädningsfaktorn.
Varje okänt prov som du satte in i spektrofotometern späddes med olika mängd. Följaktligen bör du nu dela koncentrationen du har beräknat baserat på absorbansen för varje okänd avläsning med följande:
Okänt 1: Dela med 0,1 Okänt 2: Dela med 0,2 Okänt 3: Dela med 0,3 Okänt 4: Dela med 0,4 Okänt 5: Dela med 0,5
Kom dock ihåg att dessa siffror baseras på antagandet att du använder utspädningarna ovan. Kom ihåg att ändra dessa värden om du spädde dina prover med en annan mängd.
Lägg till dina resultat tillsammans och dela dem med antalet resultat. Detta ger dig ett genomsnitt. Rapportera detta nummer som ditt resultat för koncentrationen av den ursprungliga lösningen.
Saker du behöver
- Penna
- Papper
- Kalkylator
- Handskar
- Glasögon
- Långärmad kappa
- Spektrofotometer
- Glaskuvetter
- Parafilm
- Kimwipes
- Avjoniserat vatten
- Lösning du vill testa (av okänd koncentration)
- 1 molär standardlösning av den kemikalie som finns i testlösningen
- Graduerad pipett och glödlampa
- Provrör & provrörshållare
- Bägare
Tips
Denna procedur kan låta komplicerad, men det är faktiskt ganska enkelt när du har börjat. Prova att titta på de två videorna under avsnittet Resurser för att bekanta dig med proceduren.