När du arbetar med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är god kalibrering absolut nödvändig för att säkerställa tillförlitliga kvalitetsresultat. Korrekt kalibrering av ett HPLC-instrument börjar med att skapa en lämplig kalibreringsstandard. I de flesta fall kräver kalibrering faktiskt en serie standarder för ökad koncentration för att producera det som kallas en kalibreringskurva. Detta är en ritad linje och tillhörande ekvation som beskriver förhållandet mellan koncentrationen av den kemikalie som testas för och svaret från HPLC-detektorn.
Bestäm den kemikalie som du vill testa med HPLC ("analyten"). Du kanske till exempel vill testa en serie läskedrycker för fruktosinnehåll, i vilket fall fruktos skulle vara analyten.
Skaffa en mängd av analytkemikalien med lämplig renhet. Normalt bör renheten överstiga 99% och analyten bör köpas från ett ansett kemiförsörjningsföretag. När det gäller fruktos, till exempel, skulle du köpa ren fruktos från en kemikaliehandlare och inte från en livsmedelsbutik.
Bestäm de maximala och minsta förväntade koncentrationerna av analyten i de prover du tänker testa på HPLC. När det gäller läskedrycker undersöker du etiketterna på dryckerna och bestämmer det lägsta och högsta fruktosinnehållet bland de drycker du kommer att testa. Tänk på att det ursprungliga provet (läsk) kan spädas eller på annat sätt manipuleras under förberedelse för analys (beroende på vilken HPLC-metod som används) och så kan analytkoncentrationen i de prover som faktiskt injiceras på HPLC vara ändrad. Det är analytkoncentrationen i proverna som körs på HPLC som måste beaktas.
Bestäm lösningsmedlet där du kommer att lösa upp din analyt för att göra kalibreringsstandarder. Detta lösningsmedel måste kunna lösa upp analyten ordentligt inom ett relativt brett koncentrationsområde (åtminstone lika högt som i de prover du tänker testa). Likaså bör detta lösningsmedel helst vara ganska likt den "mobila fasen:" lösningsmedlet som används för att bära prover genom HPLC-instrumentet.
Beräkna mängden analyt som krävs för att göra en "stamstandard" -lösning av analyten. Detta hittas genom att multiplicera den erforderliga koncentrationen av lagerstandarden med önskad volym. Koncentrationen av analyten i denna lösning bör vara minst 10% högre än den högsta förväntade provkoncentrationen. Om den högsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett läskprov är 8 gram / 100 ml, kan stamstandarden göras till en koncentration av 10 gram fruktos / 100 ml. En rimlig volym är 500 ml, så 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktos skulle krävas.
Väg upp den erforderliga mängden analyt till en lämplig precision. Ofta är ett viktvärde i gram exakt till en eller två decimaler lämpligt, men mer precision kan vara nödvändigt för vissa metoder.
Överför den vägda analyten till en mätkolv med den nödvändiga volymen och tillsätt önskat lösningsmedel till fyllmärket på kolven. Användning av en mätkolv (snarare än en graderad bägare, till exempel) ökar precisionen i standardkoncentrationsvärdet. Se till att all analyt överförs till kolven. använd en del av lösningsmedlet för att tvätta in det vid behov.
Gör en serie med olika utspädningar av lagerstandarden genom att överföra kända volymer av lagerstandarden till mätkolvar, med pipetter för noggrann överföring och tillsätt sedan lösningsmedel. Den lägsta standardkoncentrationen bör ligga under det lägsta förväntade provet som ska analyseras. I läskexemplet, om den lägsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett prov är 2 gram / 100 ml, kan en standard på 1 gram / 100 ml göras. Detta skulle ske genom en tiofaldig utspädning av lagerstandarden. Standardserien bör innehålla totalt 5 eller 6 koncentrationer, så ytterligare utspädningar för att producera standarder på kanske 3, 5 och 8 gram fruktos / ml skulle krävas. Du har nu en serie standardlösningar för att kalibrera HPLC.
