Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) är en biokemisk metod för att identifiera proteiner i lösning. Såsom illustreras av Mathews et al i "Biochemistry" laddas proteinprover först i "brunnar" eller hål i ena änden av polyakrylamidgelblocket. Ett elektriskt fält appliceras sedan på gelén. SDS, tillsatt till de laddade proverna, förnekar den naturliga laddningen av proteiner. Av denna anledning bestämmer proteinmolekylvikten enbart migrationshastigheten för proteiner när de rör sig genom gelén mot den positivt laddade polen, konstaterar Bitesize Bio. Flera proteiner i samma prov kommer därför att separeras från varandra och migrera till olika positioner.
Orientera gelbildet. "Top" är platsen för brunnarna där proverna ursprungligen tillsattes. "Nederst" är där proverna migrerade mot och oftast innehåller färgämnesfronten som indikerar den migrerande fronten på proverna. Antingen vänster eller höger bör innehålla en "markör", som används som en förutsägbar molekylviktsguide.
Märk proverna för varje körfält. Överst kommer de prover som läggs till brunnarna migrerat vertikalt i "körfält". Därför kom alla staplar som är synliga i en vertikal kolumn från det enda provet som laddats direkt ovanför det. Använd linjalen och pennan för att sätta gränser på banorna om det är svårt att visualisera kolumner.
Märk molekylstorlekarna på banden i markörfältet. Kommersiellt tillgängliga markörer kommer med en bild av bandmönstret att förvänta sig tillsammans med molekylvikterna för varje band. Band är de mörka horisontella "staplarna", som faktiskt är färgat protein inbäddat i gelén.
Rita lätta horisontella linjer som sträcker sig ut från varje markörband till motsatt kant av gelén. Var noga med att göra dessa linjer parallella med brunnarna och färgämnet. Dessa linjer anger var proteiner med molekylvikten som indikeras av vart och ett av markörbanden skulle vara belägna i varje fält. Till exempel ett band i spår 4 som ligger strax under linjen sträckt sig från 25 kilodalton markörband skulle föreslå att fält 4-bandet är nästan men inte riktigt 25 kilodalton i molekylär vikt.
Märk varje band i varje fil med sin beräknade molekylvikt. Använd markörerna som en guide och uppskatta värden mellan markörstorlekarna.
Gör en lista över "proteiner" för varje fil under gelbildet. Börja med att ange vad som är känt om varje prov, till exempel dess ursprung eller förhållanden. Lista sedan upp den beräknade molekylvikten för varje band i banan. Fält med ett band indikerar att provet endast innehåller ett protein. Fält med flera band indikerar närvaron av flera proteiner. Band som körs med migreringsfronten är mindre än vad som föreslås av närmaste markör och kan sannolikt inte förutsägas förutom som "mindre än" markören indikerar.
Notera konstigheter i proteinlistan. Ett "utsmetat" utseende kan indikera att för många proteiner är närvarande eller att provets viskositet påverkade dess migration Om band verkar gå utöver filens kant eller är ganska stora jämfört med andra band, då är sannolikt koncentrationen av det proteinet för hög och bör spädas i framtiden elektrofores. En gråaktig nyans i hela banan, mörkare än bakgrundsgelfärgen, indikerar oskiljbara proteinfragment.
Bestäm identiteten på proteinerna i varje körfält. Även om detta görs med enbart molekylvikt, kommer källan till varje körfält sannolikt också att ledtrådar. Tänk på att proteiner under vissa förhållanden kan upprätthålla en dimer- eller trimerförening på en gel. Därför kan ett protein förekomma på en gel som tre distinkta band. Även om proteiner inte kan identifieras, kan bandets relativa mörker innebära koncentrationerna av proteinerna i lösning. Alla nyfikna och okända proteiner kan isoleras direkt från originalgelén och skickas för identifiering.
Saker du behöver
- Foto av SDS-PAGE-gel, färgat
- Nyckel för molekylviktsmarkör som används
- Linjal
- Penna