Lyse är ett ord som kommer från grekiska och bara betyder "att splittras" eller "att spricka." avser vad som händer med celler i en lysbuffert, en lösning som bryter dem öppna för att extrahera deras innehåll. Forskare använder lysbuffertar när de extraherar DNA eller proteiner från celler för analys, särskilt när det gäller bakterier. Typen av celllysbuffert varierar beroende på typen av experiment, även om följande är några vanliga val.
TL; DR (för lång; Läste inte)
Lysbuffertar hjälper till att bryta upp celler, så att deras innehåll kan nås eller tas bort. Några exempel inkluderar salter, tvättmedel, kelatbildande medel och hämmare och några alkaliska kemikalier.
Buffert och salt
Buffertar stabiliserar pH medan cellerna delas. Tris-HCL är en av de vanligaste kemikalierna för buffring vid pH 8. HEPES är en annan vanlig buffertkemikalie i dessa experiment. Natriumkloridsalt kan också höja jonstyrkan, den totala koncentrationen av lösta ämnen utanför cellerna. Den sista punkten har viss betydelse eftersom vatten kan diffundera över cellmembran från regioner med låg koncentration av lösta ämnen till regioner med hög koncentration av lösningsmedel.
Upplösande tvättmedel
Rengöringsmedel löser upp cellmembran så att cellens innehåll kan fly. Den har och amfipatisk molekylär struktur (dvs molekyler med ena änden som interagerar lätt med vattenmolekyler medan den andra hydrofoba eller "vattenfruktande" änden inte gör det). De kan lösa upp fetter genom att bilda miceller, små kluster där tvättmedelsmolekylernas hydrofoba svansar pekar inåt mot fettmolekylerna. Vanliga detergenter inkluderar natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 och tritonX.
Kelateringsmedel och hämmare
Lysbuffertar innefattar typiskt också kelatbildande medel som etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller etylenglykoltetraättiksyra (EGTA). Dessa kemikalier binder till metalljoner med två positiva laddningar (t.ex. magnesium och kalcium), vilket gör dem otillgängliga för andra reaktioner. Många DNAser (proteiner som tuggar upp DNA) och proteaser (proteiner som skär upp andra proteiner) behöver magnesiumjoner till funktion, så genom att beröva dem denna viktiga ingrediens hjälper EDTA och EGTA till att minska nivån av proteas eller DNAse aktivitet. De utesluter det dock inte helt, och vissa proteaser beror inte på magnesiumkofaktorer, så lysbuffertar ibland även kemikalier som kallas proteashämmare, som binder till proteaser och hindrar dem från att fungera ordentligt.
Alkalisk lysis
Alkalisk lys, en mycket vanlig teknik för att rena plasmider från bakterier, innefattar tre lösningar. Den första innehåller glukos, tris-HCL-buffert, EDTA och RNAses. Glukosen skapar en hög koncentration av löst ämne utanför bakterierna så att de blir lite slappa, vilket gör dem lättare att lysera. EDTA och tris-HCL fungerar som redan beskrivits, medan RNAse kommer att tugga upp allt RNA inuti cellen för att få det ur vägen. Den andra lösningen lyserar faktiskt cellerna. Den här innehåller SDS-tvättmedel och NaOH, som höjer pH till 12 eller högre, denaturerar proteiner inuti cellen och får DNA att separeras i enstaka strängar. Den tredje lösningen innehåller kaliumacetat för att återställa pH till en mer neutral nivå så att plasmid-DNA-strängarna kan komma ihop igen. Under tiden klumpar sig denaturerade proteinerna och fälls ut, medan dodecylsulfatjoner kommer tillsammans med kaliumjonerna för att bilda en olöslig förening, som också fälls ut från lösningen.