Гел електрофореза је често коришћена лабораторијска техника са многим практичним применама, укључујући ДНК отиске прстију и секвенцирање генома. Процес укључује раздвајање ДНК фрагменти који користе електричну струју док прате брзину молекуларног кретања кроз гел за филтрирање.
Додавање плаве или наранџасте боје за праћење безбојним узорцима ДНК омогућава вам да видите свој узорак и добијете информације о томе како се молекули ДНК крећу током електрофорезе. Идентификација се заснива на величини ДНК трака на гелу након миграције молекула.
Како делује електрофореза у гелу
Гел електрофореза извлачи фрагменте ДНК кроз гел користећи електричну струју да изолује и идентификује молекуле ДНК по величини и електричном набоју. Гел се често прави са агарозни прах - полисахарид екстрахован из морске алге.
Агароза се додаје пуферском раствору воде и соли, а смеша се загрева и хлади да би се створио порозни гел који ће деловати као матрица за филтрирање током поступка електрофорезе. Затим се гел ставља у јединицу за електрофорезу и прекрива пуферским раствором који проводи електрична енергија.
Раствори који садрже ДНК и боје за пуњење се пипетирају у мале јажице у гелу које се морају направити током припреме гела. Бојепомоћи тебијасно видите узорак које додајете у гелске јамице смештене у близини негативне електроде јединице за електрофорезу.
Позитивна електрода налази се на супротном крају. Познати стандард фрагмената ДНК постављен је у први бунар који ће створити лествицу ДНК трака ради упоређивања и идентификације.
Фосфатна окосница молекула ДНК даје ДНК негативан набој. Супротности се привлаче, па су молекули ДНК привучени позитивном електродом и почињу да се крећу или „мигрирају“ када се укључи електрична струја.
Фрагменти ДНК мање величине путују брже од већих фрагмената, јер наилазе на мањи отпор док мигрирају кроз порозну матрицу гела. Фрагменти ДНК сличне величине формирају траке ДНК у гелу.
Учитавање сврхе и важности бојила
ДНК је безбојна, па додавање праћење боја узорак вам помаже одредити брзину кретања различитих молекула протеина у гелу током електрофорезе. Примери пуњења боја које се крећу са узорком ДНК укључују бромофенолПлави и ксилен цијанола.
Одабрана боја не би требало да буде реактивна или да мења ДНК. Бромофенол плава је боја која се користи за праћење мањих ДНК ланаца који садрже око 400 парова база, док је ксилен цијанол бољи за веће ланце ДНК са до 8.000 парова база. Одабрана боја не би требало да буде реактивна или да мења ДНК.
Улога глицерола у електрофорези на агарозном гелу
Када припремате свој узорак ДНК за електрофореза, мораћете да додате глицерол и воду заједно са бојама за пуњење. Глицерол је тешка сирупаста супстанца која даје већу густину узорку ДНК пре него што се убаци у јамице на једном крају гелског листа.
Без глицерола, ДНК узорак би се разишао уместо да потоне и формирао слој у бунару као што би требало да чини да би се формирала лествица ДНК.
Праћење боје на СДС СТРАНИЦИ
Електрофореза у натријум-додецил-сулфатном полиакриламидном гелу (СДС ПАГЕ) је техника погодна за раздвајање протеина и аминокиселина, који су мањи и сложенији од линеарних молекула ДНК. Полиакриламид (СДС ПАГЕ гел) се користи уместо агарозног гела за електрофорезу.
Бромофенол плаво (БПБ) се додаје у пуфер за узорке као а праћење боје који се креће у истом смеру раздвајања протеина и разграничава њихову предњу ивицу.
Улога боје за везивање ДНК
Боја која веже ДНК као што је наранџасте боје етидијум бромид се може додати у гел или у пуфер за електрофорезу. Као што и само име говори, боја се везује за молекул ДНК.
Мора се бити пажљив при руковању овом мутагеном бојом јер се она може везати за ДНК у ћелијама коже. За разлику од боја за праћење, етидијум бромид флуоресцира ведро под УВ светлост, чинећи ДНК траке видљивим.