ДНК секвенцирање: дефиниција, методе, примери

Нуклеотиди су хемијски грађевни блокови живота и налазе се у ДНК живих организама. Сваки нуклеотид се састоји од шећер, фосфат и а база која садржи азот: аденин (А), тимин (Т), цитозин (Ц) и гванин (Г). Одређени редослед ових нуклеотидних база одређује које ће протеине, ензиме и молекуле синтетизовати ћелија.

Одређивање реда или низа нуклеотида је важно за проучавање мутације, еволуција, прогресија болести, генетско тестирање, форензичка испитивања и медицина.

Геномицс је проучавање ДНК, гена, интеракције гена и утицаја околине на гене. Тајна разоткривања сложеног унутрашњег деловања гена је у томе што је могуће идентификовати њихову структуру и локацију на хромозомима.

Нацрт живих организама одређен је редоследом (или секвенцом) парова база нуклеинских киселина у ДНК. Када се ДНК реплицира, аденин се удружује са тимином, а цитозин са гванином; узимају се у обзир неусклађени парови мутације.

Од двоструке завојнице дезоксирибонуклеинска киселина (ДНА) молекул је конципиран 1953. године, направљена су драматична побољшања у пољу геномике и секвенцирању ДНК великих размера. Научници марљиво раде на томе да ово ново знање примене на индивидуализовано лечење болести.

Истовремено, текуће расправе омогућавају истраживачима да остану испред етичких импликација таквих технологија које брзо експлодирају.

ДНК секвенцирање је поступак откривања секвенце различитих нуклеотидних база у фрагментима ДНК. Секвенцирање целих гена омогућава поређење хромозома и генома присутних у истој и различитим врстама.

Мапирање хромозома корисно је за научна истраживања. Анализирајући механизме и структуру гени, алели и хромозомске мутације у молекулима ДНК сугеришу нове начине лечења генетских поремећаја и заустављања раста канцерогеног тумора, на пример.

Методе секвенцирања ДНК Фредерицка Сангера увелико напредовао у области геномике почев од 1970-их. Сангер се осећао спремним да се ухвати у коштац са секвенцирањем ДНК након успешног секвенцирања РНК током проучавања инсулина. Сангер није први научник који се бавио секвенцирањем ДНК. Међутим, његове паметне методе секвенцирања ДНК - развијене у тандему са колегама Бергом и Гилбертом - добиле су Нобелову награду 1980.

Сангер је знао потенцијалну вредност свог рада и често је сарађивао са другим научницима који су делили његова интересовања за ДНК, молекуларна биологија и наука о животу.

Иако споре и скупе у поређењу са данашњим технологијама секвенцирања, Сангерове методе секвенцирања ДНК биле су хваљене у то време. После покушаја и грешака, Сангер је пронашао тајни биохемијски „рецепт“ за одвајање нити ДНК, стварајући више ДНК и идентификујући редослед нуклеотида у геному.

Квалитетни материјали могу се лако купити за употребу у лабораторијским студијама:

• ДНК полимераза је ензим потребан за стварање ДНК.
• ДНК прајмер говори ензиму одакле да почне да ради на ДНК ланцу.
• дНТПс су органски молекули који се састоје од деоксирибозног шећера и нуклеозидних трифосфата - дАТП, дГТП, дЦТП и дТТП - који окупљају протеине
• Терминатори ланца су нуклеотиди боје обојене, звани и терминаторски нуклеотиди за сваку базу - А, Т, Ц и Г.

Сангер је смислио како ДНК исећи на мале сегменте користећи ензим ДНК полимеразу.

Затим је направио више ДНК од шаблона и у нову ДНК убацио радиоактивне трагове како би разграничио делове одвојених нити. Такође је препознао да је ензиму потребан прајмер који би могао да се веже за одређено место на ланцу шаблона. 1981. године Сангер је поново ушао у историју откривши геном 16.000 базних парова митохондријске ДНК.

Температура се мора пажљиво подешавати током процеса секвенцирања. Прво се хемикалије додају у цев и загревају да би се расплеле (денатурирале) дволанчане Молекул ДНК. Тада се температура охлади, омогућавајући прајмеру да се веже.

Даље, температура се подиже како би се подстакла оптимална активност ДНК полимеразе (ензима).

Полимераза обично користи уобичајене доступне нуклеотиде, који се додају у вишој концентрацији. Када полимераза дође до нуклеотида везаног за боју са завршетком ланца, полимераза се зауставља и ланац се тамо завршава, што објашњава зашто се обојени нуклеотиди називају „завршетак ланца“ или „Терминатори“.

Процес се наставља много, много пута. На крају, нуклеотид повезан са бојом постављен је на сваки појединачни положај секвенце ДНК. Електрофореза у гелу и рачунарски програми тада могу да идентификују боје боја на сваком од ДНК ланаца и схватите целу секвенцу ДНК на основу боје, положаја боје и дужине праменови.

Секвенцирање велике пропусности - обично се назива секвенцирање следеће генерације - користи нова унапређења и технологије за секвенцирање нуклеотидних база брже и јефтиније него икад раније. Машина за секвенцирање ДНК лако може да се носи са великим деловима ДНК. У ствари, читави геноми могу да се ураде за неколико сати, уместо година помоћу Сангерових техника секвенцирања.

Методе секвенцирања следеће генерације могу да обраде ДНК анализу великог обима без додатног корака амплификације или клонирања да би се добило довољно ДНК за секвенцирање. Машине за секвенцирање ДНК покрећу више реакција секвенцирања одједном, што је јефтиније и брже.

У основи, нова технологија секвенцирања ДНК покреће стотине Сангерових реакција на малом, лако читљивом микрочипу који се затим покреће кроз рачунарски програм који саставља секвенцу.

Техника чита краће фрагменте ДНК, али је и даље бржа и ефикаснија од Сангерових метода секвенцирања, па се чак и велики пројекти могу брзо завршити.

Тхе Пројекат људског генома, завршена 2003. године, једна је од најпознатијих студија секвенцирања урађених до данас. Према чланку из 2018. у Сциенце Невс, људски геном се састоји од приближно 46.831 гена, што је био страховит изазов за секвенцирање. Врхунски научници из целог света провели су скоро 10 година сарађујући и саветујући се. Вођени Националним истраживањем хуманог генома

Институт, пројекат је успешно мапирао људски геном користећи композитни узорак узет од анонимних давалаца крви.

Пројекат хуманог генома ослањао се на методе секвенцирања бактеријским вештачким хромозомом (БАЦ) за мапирање базних парова. Техника је користила бактерије за клонирање фрагмената ДНК, што је резултирало великим количинама ДНК за секвенцирање. Клонови су затим смањени, стављени у машину за секвенцирање и састављени у делове који представљају људску ДНК.

Нова открића у геномици дубоко мењају приступе превенцији, откривању и лечењу болести. Влада је посветила милијарде долара за истраживање ДНК. Службе за спровођење закона ослањају се на ДНК анализу да би решиле случајеве. Комплети за ДНК тестирање могу се купити за кућну употребу како би се истражило порекло и идентификовале варијанте гена које могу представљати здравствени ризик:

• Геномска анализа подразумева упоређивање и супротстављање секвенци генома многих различитих врста у доменима и царствима живота. ДНК секвенцирање може открити генетске обрасце који бацају ново светло када су одређене секвенце уведене еволуционо. Преци и миграције могу се пратити путем ДНК анализе и упоређивати са историјским записима.

• Напредак у медицини дешавају се експоненцијално брзином, јер практично свака болест човека има генетску компоненту. ДНК секвенцирање помаже научницима и лекарима да разумеју како више гена комуницира једни с другима и околином. Брзо секвенцирање ДНК новог микроба који узрокује избијање болести може помоћи у идентификовању ефикасних лекова и вакцина пре него што проблем постане озбиљан проблем јавног здравља. Варијанте гена у ћелијама рака и туморима могу се секвенцирати и користити за развој индивидуализованих генских терапија.

• Форензичка наука апликације се користе за помоћ полицији у решавању хиљада тешких случајева од касних 1980-их, наводи Национални институт за правду. Докази на месту злочина могу садржати узорке ДНК из костију, косе или телесног ткива који се могу упоређивати са ДНК профилом осумњиченог ради лакшег утврђивања кривице или невиности. Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је уобичајена метода за прављење копија ДНК из доказа у траговима пре секвенцирања.

• Секвенцирање новооткривених врста може вам помоћи да идентификујете које су друге врсте најближе повезане и откривају информације о еволуцији. Таксономи користе ДНК „бар кодове“ за класификацију организама. Према Универзитет у Џорџији маја 2018. године, процењује се да још треба открити 303 врсте сисара.

• Генетско испитивање болести потражите мутиране варијанте гена. Већина су једнонуклеотидни полиморфизми (СНП), што значи да је само један нуклеотид у секвенци промењен из „нормалне“ верзије. Фактори околине и начин живота утичу на то како и да ли се неки гени изражавају. Глобалне компаније омогућавају најсавременије технологије секвенцирања нове генерације доступне истраживачима широм света заинтересованим за мултигене интеракције и секвенцирање целог генома.

• Генеалошки ДНК комплети користите ДНК секвенце у њиховој бази података да провере да ли постоје варијанте у генима појединца. За комплет је потребан узорак пљувачке или брис образа који се поштом шаље у комерцијалну лабораторију на анализу. Поред података о прецима, неки комплети могу да идентификују полиморфизме појединачних нуклеотида (СНП) или друге добро познате генетске варијанте као што су гени БРЦА1 и БРЦА2 повезани са повишеним ризиком за женске дојке и рак јајника.

Нове технологије често долазе са могућношћу социјалне користи, као и штете; примери укључују неисправно функционисање нуклеарних електрана и нуклеарно оружје за масовно уништавање. ДНК технологије такође носе ризике.

Емоционална забринутост због секвенцирања ДНК и алата за уређивање гена попут ЦРИСПР укључује страхове да технологија може олакшати клонирање људи или довести до мутираних трансгених животиња створених од стране лупежа научник.

Чешћа етичка питања везана за секвенцирање ДНК имају везе са информисаним пристанком. Лак приступ ДНК тестирању директно према потрошачу значи да потрошачи можда неће у потпуности разумети како ће се њихове генетске информације користити, чувати и делити. Лаици можда нису емоционално спремни да уче о својим оштећеним варијантама гена и здравственим ризицима.

Треће стране попут послодаваца и осигуравајућих друштава могу потенцијално дискриминирати појединце који носе неисправне гене који могу довести до озбиљних медицинских проблема.