Електрофореза у натријум-додецил-сулфат-полиакриламидном гелу (СДС-ПАГЕ) је биохемијска метода идентификовања протеина у раствору. Као што илуструју Матхевс и сарадници у „Биохемији“, узорци протеина се прво напуне у „јаме“ или рупе на једном крају блока полиакриламидног гела. Затим се на гел наноси електрично поље. СДС, додат у напуњене узорке, негира природни набој протеина. Из тог разлога, молекуларна тежина протеина сама одређује брзину миграције протеина док се крећу кроз гел према позитивно наелектрисаном полу, напомиње Битесизе Био. Стога ће се више протеина у истом узорку одвојити једни од других и мигрирати на различите положаје.
Усмерите гел фотографију. „Врх“ је место бунара где су узорци првобитно додати. „Дно“ је место где су узорци мигрирали према и најчешће садрже фронт боје који указује на мигрирајући фронт узорака. Лево или десно треба да садрже „маркер“, који се користи као предвидљиви водич за молекуларну тежину.
Означите узорке за сваку траку. Преко врха, узорци додани у бунаре ће се вертикално мигрирати у „траке“. Према томе, све шипке видљиве у вертикалној колони потичу из једног узорка који је напуњен директно изнад њега. Користите лењир и оловку да бисте поставили ивице на траке ако је тешко визуализовати колоне.
Означите молекуларне величине трака у маркер траци. Комерцијално доступни маркери долазе са сликом узорка траке који се очекује заједно са молекуларном тежином сваке траке. Траке су тамне хоризоналне „шипке“, које су заправо обојени протеини уграђени у гел.
Нацртајте лагане водоравне линије које се протежу од сваке траке маркера до супротне ивице гела. Пазите да ове линије буду паралелне са јамицама и предњим делом боје. Ове линије показују где би се протеини молекулске тежине означени сваком маркер траком налазили у свакој траци. На пример, трака у траци 4 која се налази непосредно испод линије продужене од 25-килодалтона трака маркера сугерише да је трака 4 у молекулској структури скоро, али не сасвим 25 килодалтона тежина.
Означите сваку траку у свакој траци са њеном процењеном молекулском тежином. Користите маркере као водич и процењујте вредности између величина маркера.
Испод гелске фотографије направите листу „протеина“ за сваку траку. Започните тако што ћете навести шта је познато о сваком узорку, као што је његово порекло или услови. Затим наведите процењену молекуларну тежину сваке траке у траци. Траке са једном траком указују да узорак садржи само један протеин. Траке са више трака указују на присуство више протеина. Опсези који се покрећу са миграционим фронтом су мањи него што сугерише најближи маркер и вероватно се не могу предвидети, осим ако ознака означава „мање од”.
На листи протеина имајте на уму необичности. Измазан изглед може указивати на то да је присутно превише протеина или да је вискозност узорка утицала на његову миграцију. Ако се чини да траке прелазе границу ивице траке или су прилично велике у поређењу са другим тракама, тада је концентрација тог протеина вероватно превисока и треба је разблажити у будућности електрофореза. Сивкаста нијанса кроз целу траку, тамнија од позадинске боје гела, указује на неразлучиве фрагменте протеина.
Одредите идентитет протеина у свакој траци. Иако се то ради само помоћу молекуларне тежине, извор сваке траке ће вероватно такође указивати на трагове. Узмите у обзир да под неким условима протеини могу одржавати димере или тримере на гелу. Стога се један протеин може појавити на гелу као три различита трака. Чак и ако се протеини не могу идентификовати, релативни мрак трака може подразумевати концентрацију протеина у раствору. Сви радознали и непознати протеини могу се изоловати директно из оригиналног гела и послати на идентификацију.
Ствари које ће вам требати
- Фотографија СДС-ПАГЕ гела, обојена
- Кључ за коришћени маркер молекуларне тежине
- Лењир
- Хемијска оловка