Gel elektroforeza je pogosto uporabljena laboratorijska tehnika s številnimi praktičnimi aplikacijami, vključno z odvzemom prstnih odtisov DNK in zaporedjem genoma. Postopek vključuje ločevanje DNK fragmenti z uporabo električnega toka, medtem ko sledimo hitrosti molekularnega gibanja skozi filtrirni gel.
Če brezbarvnim vzorcem DNA dodate modro ali oranžno barvilo za sledenje, si lahko ogledate vzorec in pridobite informacije o tem, kako se molekule DNA gibljejo med elektroforezo. Identifikacija temelji na velikosti pasov DNA na gelu po migraciji molekul.
Kako deluje elektroforeza v gelu
Gel elektroforeza potegne fragmente DNA skozi gel z električnim tokom, da izolira in identificira molekule DNA po velikosti in električnem naboju. Gel je pogosto narejen z agarozni prah - polisaharid, ekstrahiran iz morske alge.
Agarozo dodamo v pufersko raztopino vode in soli, zmes pa segrejemo in ohladimo, da dobimo porozen gel, ki bo med postopkom elektroforeze deloval kot filtrirna matrica. Nato se gel postavi v enoto za elektroforezo in prekrije z pufersko raztopino, ki prevaja elektrika.
Raztopine, ki vsebujejo DNA in barvila za nalaganje, se pipetirajo v majhne vdolbinice v gelu, ki jih je treba pripraviti med pripravo gela. Barvilavam pomagajojasno vidite vzorec ki jih dodajate v jamice z gelom, ki se nahajajo v bližini negativne elektrode enote za elektroforezo.
Pozitivna elektroda se nahaja na nasprotnem koncu. Znani standard fragmentov DNA je postavljen v prvo vdolbino, ki bo ustvarila lestvico pasov DNA za primerjavo in identifikacijo.
Fosfatna hrbtenica molekul DNA daje DNK negativni naboj. Nasprotja se privlačijo, zato molekule DNA privlačijo pozitivne elektrode in se začnejo premikati ali "seliti", ko je vklopljen električni tok.
Manjši fragmenti DNA potujejo hitreje kot večji, ker naletijo na manjši odpor, ko se selijo skozi porozno matriko gela. Podobno veliki fragmenti DNA tvorijo trakove DNA v gelu.
Nalaganje barvila Namen in pomen
DNA je brezbarvna, zato dodajanje sledenje barvil vam pomaga vzorec določite hitrost gibanja beljakovin različnih velikosti v gelu med elektroforezo. Primeri nalaganja barvil, ki se premikajo z vzorcem DNA, vključujejo bromofenolmodra in ksilen cianol.
Izbrano barvilo ne sme biti reaktivno ali spreminjati DNA. Bromofenol modro je barvilo, ki se uporablja za sledenje manjših verig DNA, ki vsebujejo približno 400 baznih parov, medtem ko je ksilen cianol boljši za večje verige DNA z do 8000 baznimi pari. Izbrano barvilo ne sme biti reaktivno ali spreminjati DNA.
Vloga glicerola v elektroforezi z agaroznim gelom
Ko pripravljate svoj vzorec DNK za elektroforeza, boste morali dodati glicerol in vodo skupaj z barvili za nalaganje. Glicerol je težka, sirupna snov, ki daje večjo gostoto vzorcu DNA, preden ga vstavimo v jamice na enem koncu gelnega lista.
Brez glicerola bi se vzorec DNA razpršil, namesto da bi potonil in v vodnjaku ustvaril plast, kot naj bi to naredil za oblikovanje lestve DNA.
Sledenje barvilom na strani SDS PAGE
Elektroforeza v natrijevem dodecil sulfatu v poliakrilamidnem gelu (SDS PAGE) je tehnika, primerna za ločevanje beljakovin in aminokislin, ki so manjše in bolj zapletene od linearnih molekul DNA. Namesto agaroznega gela za elektroforezo se uporablja poliakrilamid (SDS PAGE gel).
Bromofenol modro (BPB) se doda v pufer za vzorce kot a sledilno barvilo ki se premika v isti smeri ločevanja beljakovin in razmejuje njihov vodilni rob.
Vloga barvila, ki veže DNA
DNA-vezavno barvilo, kot je oranžno obarvana etidijev bromid lahko dodamo v gel ali v pufer za elektroforezo. Kot že ime pove, se barvilo veže na molekulo DNA.
Pri ravnanju s tem mutagenim barvilom je treba biti zelo previden, ker se lahko veže na DNA v kožnih celicah. Za razliko od barvil za sledenje, etidijev bromid fluorescira svetlo pod UV svetloba, zaradi česar so vidni pasovi DNA.