Prednosti in slabosti Western blota

Western blot, analitična tehnika, ki se uporablja za določitev določenega proteina v določenem vzorcu, uporablja sposobnost primarnega protitelesa, označenega z encima ali fluorescenco, da se veže na njegov specifični antigen. To je postopek v treh korakih, ki se začne z elektroforezo v gelu, čemur sledi blotiranje z membrano in sondiranje s protitelesi. Zaznavanje beljakovin je lahko neposredno ali posredno, pri čemer slednje uporablja označeno sekundarno protitelo, usmerjeno proti primarnemu. Čeprav je Western blot sprejet kot rutinska tehnika analize beljakovin, ima svoje omejitve in koristi.

Eden največjih argumentov v prid Western blotu je njegova občutljivost. Zaradi svoje sposobnosti, da v vzorcu zazna le 0,1 nanograma beljakovin, lahko tehnika teoretično služi kot učinkovito zgodnje diagnostično orodje, ki pri pacientu zazna tudi najmanjši imunogeni odziv virusa ali bakterije vzorec. Posredni vestern blot nadalje gradi na tej občutljivosti iz sposobnosti sekundarnega protitelesa, da ojača jakost signala, ki ga zazna slikovni sistem. Večja občutljivost pomeni, da je za testiranje potrebno manj protiteles, kar znatno zmanjša laboratorijske stroške.

Tehnika Western blot svojo specifičnost dolguje dvema pomembnima dejavnikoma. Najprej gelna elektroforeza sortira vzorec na beljakovine različnih velikosti, naboja in konformacije. Ta postopek je že sam po sebi velik korak k odkrivanju, saj trakovi, ki nastanejo v gelu, že dajejo namige o velikosti beljakovin ali polipeptida, ki nas zanima. Specifičnost interakcije protitelo-antigen je drugi pomemben dejavnik. Ker specifična protitelesa kažejo afiniteto do določenih beljakovin, lahko postopek selektivno zazna ciljni protein tudi v mešanici 300.000 različnih beljakovin.

Kljub občutljivosti in specifičnosti lahko vestern blot še vedno daje napačne rezultate. Lažno pozitivni rezultati, ko protitelo reagira z beljakovinami, ki niso namenjene, kar je pogosto zgodi, ko ima bolnik, ki se testira na HIV, tuberkulozo ali vrsto parazitov okužbe. Po drugi strani lahko pride do lažno negativnega, če večji proteini ne dobijo dovolj časa, da se pravilno prenesejo v membrano. Nepravilno blotiranje in obdelava pogosto povzročata poševne, zbledele ali celo več trakov, zaradi česar so rezultati preskusov odvisni od razlage tehnika.

Stroški Western blota so sestavljeni iz velikih individualnih izdatkov za označena protitelesa, usposobljene analitike in laboratorijsko opremo. Občutljiv postopek, Western blot zahteva natančnost v vsakem koraku za pravilno identifikacijo sestavin vzorca. Manjša napaka v koncentraciji reagenta ali v inkubacijskem obdobju je lahko katastrofalna za celoten postopek. Nazadnje je oprema, potrebna za zaznavanje in slikanje - kemiluminescentni, fluorescenčni, radioaktivni ali laserski sistemi za zaznavanje - za povprečno mikrobiološko enoto lahko predraga.