Čo je to Freeze Fracturing a prečo je to užitočné v bunkovej biológii?

Bunkové membrány pozostávajú z fosfolipidov a pripojených alebo zabudovaných proteínov. Membránové proteíny majú zásadnú úlohu v metabolizme a živote bunky. Na vizualizáciu alebo charakterizáciu adhéznych proteínov, transportných proteínov a proteínových kanálov v bunkovej membráne nemôžete použiť bežnú mikroskopiu. Pomocou elektrónovej mikroskopie a techniky nazývanej „freeze fracture“, ktorá rozdeľuje zmrznuté bunkové membrány od seba, umožňuje vizualizáciu membránovej štruktúry a organizácie proteínov v mori mora fosfolipidy. Kombinácia ďalších metód s mrazovým štiepením nám pomáha nielen pochopiť štruktúru rôznych bunkových membrán a membránové proteíny, ale umožňuje vizualizáciu a podrobnú analýzu funkcie špecifických proteínov, baktérií a vírusy.

Pomocou tekutého dusíka sa vzorky biologického tkaniva alebo bunky rýchlo zmrazia, aby sa imobilizovali zložky buniek. Bunkové membrány sa skladajú z dvoch vrstiev fosfolipidov, ktoré sa nazývajú dvojvrstva, kde hydrofóbne alebo vodu nenávidiace lipidové konce odkazujú na vnútro membrány a hydrofilné alebo vodou milujúce konce molekuly lipidu smerujú von a dovnútra membrány bunka. Zmrazená vzorka je prasknutá alebo zlomená mikrotómom, ktorý je nožovým nástrojom na rezanie tenkých plátkov tkaniva. To spôsobí, že bunková membrána sa rozdelí presne medzi dve vrstvy, pretože príťažlivosť medzi hydrofóbnymi lipidovými chvostmi predstavuje najslabšie miesto. Po štiepení vzorka podstúpi vákuový postup, ktorý sa nazýva „zmrazenie leptaním“. Povrch zlomený vzorka je zatienená uhlíkom a platinou, aby vznikla stabilná replika, ktorá sleduje kontúry zlomeniny lietadlo. Kyselina sa používa na trávenie organického materiálu priľnutého k replike, pričom na povrchu zlomenej membrány zostáva tenký platinový obal. Tento plášť sa potom analyzuje elektrónovou mikroskopiou.

Mrazivé leptanie je vákuové sušenie nefixovanej, zmrazenej a mrazom zlomenej biologickej vzorky. Postup vákuového sušenia je podobný ako pri mrazení sušeného ovocia a zeleniny, ktoré sú balené a predávané v obchodoch s potravinami. Bez leptania mrazom je veľa detailov bunkovej štruktúry zakrytých ľadovými kryštálmi. Krok hlbokého alebo zmrazeného leptania vylepšuje a rozširuje pôvodnú metódu fraktúry zmrazením, čo umožňuje pozorovanie bunkových membrán počas rôznych aktivít. Umožňuje analýzu nielen membránovej štruktúry, ale aj intracelulárnych zložiek a poskytuje podrobné štrukturálne informácie o baktériách, vírusoch a veľkých bunkových proteínoch komplexy.

Elektrónová mikroskopia dokáže odhaliť a zväčšiť viac ako miliónkrát najmenšie organizmy alebo štruktúry, ako sú baktérie, vírusy, intracelulárne zložky a dokonca aj proteíny. Vizualizácia sa vytvára bombardovaním ultratenkej vzorky lúčom elektrónov. Dve metódy elektrónovej mikroskopie sú skenovacia elektrónová mikroskopia alebo SEM a transmisná elektrónová mikroskopia alebo TEM. Vzorky zmrazených zlomenín sa rutinne analyzujú pomocou TEM. TEM má lepšie rozlíšenie ako SEM a ponúka štrukturálne informácie až do 3 nanometrov replík.

Vývoj a použitie elektrónovej mikroskopie so zmrazenou zlomeninou ukázali, že bunkové plazmatické membrány sú tvorené lipidovými dvojvrstvami, a objasnilo, ako sú proteíny usporiadané v bunkových membránach. Zlomenina zmrazením poskytuje jedinečný pohľad na vnútro bunkových membrán, pretože rozdeľuje a rozdeľuje membránové fosfolipidy na dva protiľahlé a komplementárne listy alebo tváre. Za viac ako 50 rokov od uvedenia prvého stroja na vymrazovanie lomov je výroba repliky platiny stále jediným spôsobom, ako získať štrukturálne informácie o bunkovej membráne. Táto technika ukazuje, či špecifické proteíny plávajú alebo sú ukotvené v bunkovej membráne a či a ako sa niektoré proteíny agregujú. Novšia metóda - využívajúca protilátky, ktoré sa zameriavajú na špecifické proteíny - je kombinovaná s freeze fracture na identifikáciu proteínov a ich funkcií v bunkovej membráne.