V molekulárnej biológii môže byť dobrý výber tlmivého roztoku a príprava na rôzne kroky izolácie DNA rozdiel medzi prechodom na expresiu proteínov alebo otvorením ďalšej sady maxi-prep na začiatok cez. Napriek svojej zásadnej dôležitosti sú recepty pufrov často práve to - recepty napísané bez vysvetlenia alebo zdôvodnenia pre rôzne komponenty. Jedným takým pufrom je pufor glukóza-tris-EDTA alebo GTE.
Na čo sa používa GTE?
GTE sa používa na resuspendáciu peliet bakteriálnych buniek pred lýzou (rozbitím) buniek a zberom plazmidovej DNA vo vnútri. Spolu s tlmivým roztokom GTE sa často pridáva lyzozým, ktorý zmäkčuje bunkové membrány. Dosiahnutie homogénnej suspenzie celých buniek počas tohto kroku, aby sa následne pridaný lýzovací roztok mohol dostať ku všetkým bunkám, je kľúčom k dosiahnutiu dobrých výťažkov DNA. GTE je navrhnuté tak, aby poskytovalo stabilné prostredie pre DNA.
Glukóza pre osmolaritu
50mM (milimolárny) glukózový cukor sa pridá do tlmivého roztoku GTE, aby sa udržala osmolarita, kde koncentrácia rozpustenej látky mimo buniek je blízka koncentrácii vo vnútri buniek. Tým sa zabráni predčasnej lýze buniek, ktorá môže spôsobiť nižšie výťažky DNA v dôsledku agregácie a degradácie. Ostatné zložky pufra tiež prispievajú k osmolarite roztoku, ale glukóza, je neelektrolyt, je dobrou voľbou, pretože nezasahuje do tlmivého roztoku vlastnosti.
Tris pre stabilitu pH
Tris je skrátený názov pre tris (hydroxymetyl) aminometán, ktorý je veľmi častým pH pufrom. V prípade tlmivého roztoku GTE sa k tlmivému roztoku pridá kyslá soľ (Tris-HCl) v koncentrácii 25 mM. To udržuje pH roztoku na takmer fyziologickej hodnote 8,0, čo je ideálne pH na prevenciu kyslej hydrolýzy (degradácie) plazmidovej DNA a nežiaducich vedľajších reakcií ostatných zložiek bunky.
EDTA zabraňuje degradácii DNA
EDTA alebo kyselina etyléndiamíntetraoctová zachytáva alebo „chelátuje“ kovové ióny z roztoku a bráni im v účasti na nežiaducich vedľajších reakciách. V tlmivom roztoku GTE sa pridá EDTA v koncentrácii 10 mM. Jeho primárnym účelom je v pufri zaokrúhľovať voľný zinok, horčík a vápnik, čím zabraňuje degradácii DNA určitými cestami, ktoré tieto kovy vyžadujú.
Niekoľko dôležitých tipov
Pufr GTE uchovávajte studený a pripravujte ho v malom množstve, aby ste zabránili množeniu nechcených baktérií. Cukor a kontrolované pH vytvárajú skvelé rastové médium. Vždy používajte vyčistenú vodu. Voda z vodovodu môže mať z potrubí prebytok kovových iónov, čo môže prekonať schopnosť EDTA zachytávať. Ak máte podozrenie na prítomnosť interferujúcej RNA vo svojej vzorke, pridajte do svojho GTE pufru RNázu A v množstve 100 mikrogramov na mililiter, aby ste problém eliminovali.
