Molekulárne klonovanie je bežná biotechnologická metóda, ktorú by mal poznať každý študent a vedecký pracovník. Molekulárne klonovanie pomocou typu enzýmu nazývaného reštrikčný enzým na rozrezanie ľudskej DNA na fragmenty, ktoré sa potom môžu vložiť do plazmidovej DNA bakteriálnej bunky. Reštrikčné enzýmy rozrezali dvojvláknovú DNA na polovicu. V závislosti od reštrikčného enzýmu môže mať rez za následok buď lepivý koniec, alebo tupý koniec. Lepivé konce sú užitočnejšie pri molekulárnom klonovaní, pretože zaisťujú, že fragment ľudskej DNA je vložený do plazmidu správnym smerom. Ligačný proces alebo fúzia fragmentov DNA vyžaduje menej DNA, ak má DNA lepkavé konce. A konečne, niekoľko reštrikčných enzýmov s lepiacim koncom môže produkovať rovnaký lepivý koniec, aj keď každý enzým rozpoznáva inú reštrikčnú sekvenciu. To zvyšuje pravdepodobnosť, že vaša oblasť záujmu DNA môže byť vystrihnutá pomocou lepkavých koncových enzýmov.
Reštrikčné enzýmy a stránky s obmedzením
Restrikčné enzýmy sú enzýmy, ktoré štiepia rozpoznávajú špecifické sekvencie na dvojvláknovej DNA a rozrezávajú DNA na polovicu v tejto sekvencii. Rozpoznaná sekvencia sa nazýva restrikčné miesto. Reštrikčné enzýmy sa nazývajú endonukleázy, pretože štiepia dvojvláknovú DNA, a tak DNA bežne existuje, na miestach, ktoré sú medzi koncami DNA. Existuje viac ako 90 rôznych reštrikčných enzýmov. Každý rozpoznáva odlišné miesto obmedzenia. Reštrikčné enzýmy štiepia svoje príslušné reštrikčné miesta 5 000-krát účinnejšie ako iné miesta, ktoré nerozpoznávajú.
Správna orientácia
Reštrikčné enzýmy sa delia do dvoch všeobecných tried. Buď rozrezali DNA na lepkavé konce alebo tupé konce. Lepivý koniec má krátku oblasť nukleotidov, stavebných kameňov DNA, ktorá je nespárovaná. Tento nespárovaný región sa nazýva previs. O previse sa hovorí, že je lepkavý, pretože to chce a bude spárovať s iným lepivým koncom, ktorý má komplementárnu postupnosť previsu. Lepkavé konce sú ako dávno stratené dvojčatá, ktoré sa snažia po objatí pevne objať. Na druhej strane, tupé konce nie sú lepivé, pretože všetky nukleotidy sú už spárované medzi dvoma reťazcami DNA. Výhodou lepivých koncov je, že fragment ľudskej DNA sa môže zmestiť do bakteriálneho plazmidu iba jedným smerom. Naproti tomu, ak má ľudská DNA aj bakteriálny plazmid tupé konce, môže byť ľudská DNA vložená do plazmidu hlava-chvost alebo koniec-hlava-hlava.
Ligácia lepivých koncov vyžaduje menej DNA
Aj keď sa DNA s tyčinkami končí ľahšie kvôli vzájomnej lepivosti, lepivé konce ani tupé konce sa nemôžu spojiť do súvislého kúska DNA. Tvorba súvislého kúska DNA, ktorá je úplne spojená, si vyžaduje enzým nazývaný ligáza. Ligázy spájajú chrbticu nukleotidov na lepivých alebo tupých koncoch, čo vedie k súvislému reťazcu nukleotidov. Pretože lepkavé konce sa navzájom nájdu rýchlejšie kvôli vzájomnej príťažlivosti, proces ligácie vyžaduje menej ľudskej DNA a menej plazmidovej DNA. Tupé konce DNA a plazmidov sú menej pravdepodobné, že sa nájdu, a preto ligácia tupých koncov vyžaduje, aby sa do skúmavky vložilo viac DNA.
Rôzne enzýmy môžu mať rovnaký lepkavý koniec
Miesta obmedzenia sú umiestnené v celom genóme organizmov, ale nie sú rovnomerne rozmiestnené. V plazmidoch môžu byť skonštruované tak, aby boli umiestnené hneď vedľa seba. Vedci, ktorí chcú vystrihnúť fragment ľudskej DNA z ľudského genómu, musia nájsť restrikčné miesta v prednej a zadnej časti oblasti fragmentu. Okrem zaistenia toho, že fragment DNA je vložený správnym smerom, môžu rôzne enzýmy s lepiacim koncom vytvárať rovnaký lepivý koniec, aj keď rozpoznávajú rôzne reštrikčné sekvencie. Napríklad BamHI, BglII a Sau3A majú rôzne rozpoznávacie sekvencie, ale produkujú rovnaký lepivý koniec GATC. To zvyšuje pravdepodobnosť, že budú existovať miesta s obmedzujúcim lepkavým koncom, ktoré lemujú váš ľudský gén, ktorý vás zaujíma.
