Zdroj reštrikčných enzýmov

Od objavenia reštrikčných enzýmov pole molekulárnej biológie rýchlo napredovalo vďaka jedinečnej schopnosti týchto proteínov štiepiť DNA špecifickým spôsobom. Tieto jednoduché enzýmy mali výrazný vplyv na výskum na celom svete; napodiv, máme baktérie, ktorým môžeme poďakovať za tento vedecký dar.

Reštrikčné enzýmy, ktoré sa tiež nazývajú restrikčné endonukleázy, sa viažu na DNA a štiepia dvojreťazec a vytvárajú menšie kúsky DNA. Existujú tri typy reštrikčných enzýmov; Reštrikčné enzýmy typu I rozpoznávajú DNA sekvenciu a prerezávajú vlákno náhodne viac ako tisíc párov báz od miesta. Reštrikčné enzýmy typu II, najužitočnejšie pre laboratóriá molekulárnej biológie, rozpoznávajú a rozrezávajú vlákno DNA predvídateľne na špecifickú sekvenciu, ktorá je zvyčajne dlhá menej ako desať párov báz. Reštrikčné enzýmy typu III sú podobné typu I, ale tieto DNA štiepia asi tridsať párov báz od rozpoznávacej sekvencie.

Bakteriálne druhy sú hlavným zdrojom komerčných reštrikčných enzýmov. Tieto enzýmy slúžia na ochranu bakteriálnych buniek pred inváziou cudzej DNA, ako sú sekvencie nukleových kyselín používané vírusmi na ich replikáciu vo vnútri hostiteľskej bunky. Enzým v zásade rozseká DNA na oveľa menšie kúsky, ktoré pre bunku predstavujú malé nebezpečenstvo. Enzýmy sú pomenované pre druhy a kmene baktérií, ktoré ju produkujú. Napríklad prvý reštrikčný enzým extrahovaný z kmeňa Escherichia coli kmeň RY13 sa nazýva EcoRI a piaty enzým extrahovaný z rovnakého druhu sa nazýva EcoRV.

Používanie reštrikčných enzýmov typu II je v laboratóriách po celom svete takmer univerzálne. Molekuly DNA sú extrémne dlhé a je ťažké ich správne zvládnuť, najmä ak sa výskumný pracovník zaujíma iba o jeden alebo dva gény. Reštrikčné enzýmy umožňujú vedcovi spoľahlivo rozrezať DNA na oveľa menšie časti. Táto schopnosť manipulovať s DNA umožnila pokrok v reštrikčnom mapovaní a molekulárnom klonovaní.

V laboratóriu je veľmi užitočné a pohodlné presne vedieť, kde sa nachádzajú určité restrikčné miesta na reťazci DNA. Pokiaľ je DNA sekvencia známa, môže byť reštrikčné mapovanie urobené počítačom, ktorý dokáže rýchlo zmapovať všetky možné sekvencie pre rozpoznávanie reštrikčných enzýmov. Ak nie je známa sekvencia DNA, výskumník môže vytvoriť všeobecnú mapu tak, že na rozštiepenie molekuly použije rôzne enzýmy samotné a v spojení s inými enzýmami. Pomocou deduktívneho uvažovania je možné vytvoriť všeobecnú mapu obmedzení. Pri klonovaní génov je rozhodujúce mať k dispozícii mapu s obmedzením.

Molekulárne klonovanie je laboratórna technika, pri ktorej je gén štiepený z cieľovej molekuly DNA, zvyčajne extrahovanej z organizmu, reštrikčnými enzýmami. Ďalej je gén vložený do molekuly nazývanej vektor, čo sú zvyčajne malé kúsky kruhová DNA nazývaná plazmidy, ktoré boli modifikované tak, aby niesli niekoľko cieľov reštrikčných enzýmov sekvencie. Vektor sa otvorí štiepením pomocou reštrikčných enzýmov a potom sa gén vloží do kruhovej DNA. Enzým nazývaný DNA ligáza môže potom reformovať kruh tak, aby obsahoval cieľový gén. Len čo je gén takýmto spôsobom „naklonovaný“, môže byť vektor vložený do bakteriálnej bunky, aby mohol produkovať proteín.