Rekombinantná DNA (deoxyribonukleová kyselina) je syntetický typ nukleovej kyseliny vytvorený spojením DNA sekvencie dohromady, ktoré by za normálnych okolností a za normálnych okolností prirodzene neexistovali podmienky.
Proces výroby rekombinantnej DNA sa zvyčajne uskutočňuje s rekombinantným plazmidom. Konkrétne sa vyrába pokrokovým technologickým postupom DNA v biológii a genetike známym ako klonovanie génov. Rekombinantná DNA sa vloží do bunky, ktorá potom produkuje úplne nový proteín, a použije sa na syntézu liekov, protilátok alebo špecifických proteínov iba na účely výskumu.
Úvod do technológie rekombinantnej DNA
DNA z darcovského organizmu alebo biologického zdroja sa najskôr extrahuje z buniek a potom sa podrobí procesu rezania známemu ako enzymatické obmedzenie. Takto sa vytvárajú fragmenty DNA, ktoré obsahujú požadovaný gén alebo gény. Tieto fragmenty potom môžu byť „klonované“ (t.j. vložené) alebo nalepené na fragmenty z organizmu príjemcu.
Ďalej sa vložia do väčších molekúl DNA („rekombinantný plazmid“), ktoré sa umiestnia do baktérie a nechajú sa množiť. Rekombinantná DNA sa potom izoluje a overí.
Prečítajte si viac o výhodách a nevýhodách technológie rekombinantnej DNA.
Izolácia DNA
DNA musí byť najskôr extrahovaná a purifikovaná z iných bunkových molekúl, ako sú ribonukleové kyseliny (RNA), proteíny a štruktúry, ako sú bunkové membrány. Na účely klonovania sa DNA získava z jadra a je známa ako „genómová DNA“. Jedna z bežných metód pre DNA extrakcia spočíva v ultracentrifugácii bunkových zložiek v gradiente hustoty vytvorenom z etídiumbromidu v céziu chlorid.
Alternatívne je možné na získanie DNA použiť aj sériu alkalických premývaní a premytí soľným pufrom. Akonáhle je táto vyzrážaná a očistená od všetkých ostatných nežiaducich kontaminantov, môže byť DNA rozrezaná na fragmenty.
Trávenie DNA reštrikčným enzýmom
Restrikčné enzýmy sú enzýmy, ktoré štiepia veľmi špecifické sekvencie DNA; používajú sa na vytvorenie jedinečných fragmentov DNA. Tento proces zaisťuje, že sa nevytvárajú a nestávajú žiadne nepresné, nesprávne alebo nežiaduce sekvencie náhodne zabudovaný do konečnej rekombinantnej DNA, čo môže mať za následok experimentálne zlyhanie aj bunková smrť.
Na generovanie požadovaných fragmentov DNA sa na rozštiepenie alebo štiepenie DNA použije špecifický jediný (-é) enzým (-y). Fragmenty sa potom purifikujú gélovou elektroforézou, ktorá ich oddelí od nežiaducej DNA. Metóda Cruderovej DNA jednoducho zahŕňa mechanické strihanie, ktoré roztrhne dlhšie segmenty DNA na menšie, ktoré sa dajú použiť na klonovanie.
Ligácia DNA
Ligácia je proces zlepenia alebo spojenia fragmentov DNA darcu a príjemcu (alebo vektora) za vzniku molekuly rekombinantnej plazmidovej DNA. V ideálnom prípade by boli reštrikčné enzýmy zvolené na vytvorenie fragmentov veľmi starostlivo premyslené a navrhnuté tak, aby umožňovali tieto kúsky skladať ako skladačka.
Za týmto účelom sú výhodné reštrikčné enzýmy, ktoré produkujú kompatibilné „lepivé konce“, takže všetky kompatibilné fragmenty sa prirodzene navzájom spoja. Inak sa môže enzým DNA ligáza použiť na spojenie segmentov DNA s fosfodiesterovými väzbami.
Replikácia rekombinantnej DNA
Proces transformácie alebo tepelného šoku sa používa na vloženie molekuly rekombinantnej DNA do hostiteľskej bakteriálnej bunky, ktorá potom môže generovať veľa kópií syntetickej DNA. Tieto baktérie sa pestujú na agarových platniach, kultivujú sa v špeciálnych bakteriálnych bujónoch a potom sa lyžujú, aby sa uvoľnila rekombinantná DNA. Nakoniec môže byť DNA overená sekvenovaním DNA, funkčnými experimentmi a štiepením restrikčnými enzýmami.
Používa sa na rekombinantnú DNA
Technológia rekombinantnej DNA sa používa na všetko od akademických laboratórnych experimentov po výrobu farmaceutických liekov. Je tiež dôležitou súčasťou sekvenovania DNA a identifikácie génov.
Môžete si prečítať viac podobných použití Technológia DNA tu.
Prečítajte si viac o rozdieloch medzi rekombinantnou DNA a genetickým inžinierstvom.
