Biochemici a molekulárni biológovia používajú elektroforézu na oddelenie makromolekúl, ako sú proteíny a nukleové kyseliny. To umožňuje vedcom izolovať a analyzovať jednotlivé proteíny alebo sekvencie nukleových kyselín v komplexnej zmesi. Typickým príkladom elektroforézy v laboratóriu je mikrobiológ, ktorý na separáciu fragmentov DNA produkovaných v mikrobiálnej komunite používa polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Bez ohľadu na účel vyžaduje elektroforéza vždy použitie tlmivého roztoku.
TL; DR (príliš dlhý; Nečítali)
Elektroforéza oddeľuje makromolekuly ako proteín a nukleové kyseliny podľa veľkosti, náboja a ďalších vlastností. Na elektroforézu, ktorá sa oddeľuje nábojom, používajú vedci na prenos tohto náboja cez gél tlmivý roztok. Pufr tiež udržuje gél na stabilnom pH, minimalizuje zmeny, ktoré by mohli nastať v proteíne alebo nukleovej kyseline, ak sú vystavené nestabilnému pH.
Princípy elektroforézy
Elektroforéza oddeľuje molekuly pozdĺž gradientu na základe ich veľkosti, náboja alebo iných vlastností. Týmto gradientom môže byť elektrické pole alebo v prípade denaturačnej gradientovej gélovej elektroforézy (DGGE) denaturačný prostriedok, ako je napríklad zmes močoviny a formamidu. Bielkoviny budú migrovať smerom k anóde, ak sú negatívne nabité, a ku katóde, ak sú kladne nabité. Keďže väčšie molekuly migrujú pomalšie ako menšie molekuly, vedci môžu merať prejdenú vzdialenosť a pomocou logaritmov určiť veľkosť fragmentov.
Denaturačná gradientová gélová elektroforéza
Pomocou DGGE sa DNA pohybuje pozdĺž gradientu zvyšujúcej sa denaturačnej sily, až kým nie je dostatočná na to, aby tento konkrétny fragment DNA úplne denaturovala alebo rozvinula. V tomto okamihu sa migrácia zastaví. Vedci môžu pomocou tejto metódy separovať fragmenty na základe ich individuálnej náchylnosti na denaturáciu.
Čo robí Buffer
V prípade elektroforézy, ktorá sa oddeľuje na základe náboja, prenášajú ióny v pufri náboj potrebný na separáciu. Pufr, ktorý poskytuje rezervoár slabej kyseliny a zásady, tiež udržuje pH v úzkom rozmedzí. To je dôležité, pretože štruktúra a náboj proteínu alebo nukleovej kyseliny sa zmenia, ak sú vystavené významným zmenám pH, čo zabraňuje správnej separácii.
Typické nárazníky
Pre udržanie elektroforetického gélu na rôznych požadovaných rozsahoch pH sú ideálne rôzne pufre. Typické pufre, ktoré používajú vedci na tento účel, zahŕňajú kyselinu octovú, kyselinu boritú, kyselinu fosforečnú a kyselinu citrónovú, ako aj glycín a taurín. Všeobecne by hodnota pKa (konštanta disociácie kyseliny) mala byť blízko požadovaného pH. Pre nás sú lepšie nárazníky, ktoré poskytujú veľkosť malého náboja, aby nevykonávali príliš veľa prúdu.