Pri práci s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) je nevyhnutná dobrá kalibrácia, aby sa zabezpečili spoľahlivé a kvalitné výsledky. Správna kalibrácia prístroja HPLC začína vytvorením vhodného kalibračného štandardu. Vo väčšine prípadov kalibrácia v skutočnosti vyžaduje sériu štandardov zvyšovania koncentrácie, aby sa dala vytvoriť takzvaná kalibračná krivka. Toto je zakreslená čiara a súvisiaca rovnica, ktorá popisuje vzťah medzi koncentráciou testovanej chemikálie a reakciou detektora HPLC.
Určte chemickú látku, ktorú chcete testovať pomocou HPLC („analyt“). Môžete napríklad vyskúšať sériu nealkoholických nápojov na obsah fruktózy, v takom prípade bude analytom fruktóza.
Získa sa také množstvo analytickej chemikálie, ktoré má vhodnú čistotu. Normálne by čistota mala byť nad 99% a analyt by sa mal kupovať od renomovanej spoločnosti dodávajúcej chemikálie. Napríklad v prípade fruktózy by ste si kúpili čistú fruktózu od dodávateľa chemikálií, a nie od obchodu s potravinami.
Určte maximálnu a minimálnu predpokladanú koncentráciu analytu vo vzorkách, ktoré chcete testovať na HPLC. V prípade nealkoholických nápojov by ste mali preskúmať štítky nápojov a určiť najnižší a najvyšší obsah fruktózy medzi nápojmi, ktoré budete testovať. Pamätajte, že počiatočná vzorka (nealkoholický nápoj) môže byť počas prípravy na analýzu zriedená alebo inak manipulovaná (v závislosti na použitej metóde HPLC), a tak môže byť koncentrácia analytu vo vzorkách skutočne injikovaných na HPLC upravené. Musí sa brať do úvahy koncentrácia analytu vo vzorkách použitých pri HPLC.
Určte rozpúšťadlo, v ktorom rozpustíte svoj analyt, aby ste vytvorili kalibračné štandardy. Toto rozpúšťadlo musí byť schopné správne rozpustiť analyt v relatívne širokom rozmedzí koncentrácií (minimálne tak vysokých ako vo vzorkách, ktoré chcete testovať). Toto rozpúšťadlo by tiež malo byť v ideálnom prípade celkom podobné „mobilnej fáze“: rozpúšťadlu použitému na prenos vzoriek cez prístroj HPLC.
Vypočítajte množstvo analytu potrebné na prípravu „zásobného štandardného“ roztoku analytu. Zistí sa to tak, že sa požadovaná koncentrácia štandardu zásob vynásobí požadovaným objemom. Koncentrácia analytu v tomto roztoku by mala byť minimálne o 10% vyššia ako najvyššia predpokladaná koncentrácia vzorky. Ak je najvyššia očakávaná koncentrácia fruktózy vo vzorke nealkoholického nápoja 8 gramov / 100 mililitrov, potom je možné pripraviť štandardný roztok na koncentráciu 10 gramov fruktózy / 100 mililitrov. Primeraný objem je 500 mililitrov, takže je potrebných 8/100 ml x 500 ml = 40 gramov fruktózy.
Odvážte požadované množstvo analytu s vhodnou úrovňou presnosti. Často je vhodná hodnota hmotnosti v gramoch s presnosťou na jedno alebo dve desatinné miesta, pre niektoré metódy však môže byť potrebná vyššia presnosť.
Odvážený analyt sa prenesie do odmernej banky s potrebným objemom a pridá sa požadované rozpúšťadlo po značku plnenia banky. Použitie odmernej banky (napríklad namiesto odmernej kadičky) zvyšuje presnosť hodnoty štandardnej štandardnej koncentrácie. Zaistite, aby sa všetok analyt preniesol do banky; ak je to potrebné, použite na umytie časť rozpúšťadla.
Pripravte sériu rôznych zriedení zásobného štandardu prevedením známych objemov zásobného štandardu do odmerných baniek pomocou pipiet na presný prenos a potom pridajte rozpúšťadlo. Najnižšia štandardná koncentrácia by mala byť pod najnižšou očakávanou vzorkou, ktorá sa má analyzovať. V príklade nealkoholických nápojov, ak je najnižšia očakávaná koncentrácia fruktózy vo vzorke 2 gramy / 100 ml, je možné pripraviť štandard 1 gram / 100 ml. Toto by bolo dosiahnuté desaťnásobným zriedením akciového štandardu. Štandardná séria by mala obsahovať celkom 5 alebo 6 koncentrácií, takže by bolo potrebné ďalšie riedenie, aby sa vytvorili štandardy asi 3, 5 a 8 gramov fruktózy / ml. Teraz máte k dispozícii sériu štandardných riešení, pomocou ktorých môžete kalibrovať HPLC.