Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je technika na laboratórnu analýzu zmesi. Je to efektívny typ chromatografie, ktorá využíva na pretlačenie vzorky zmesi cez kolónu vysoký tlak, a nie iba gravitáciu. Vstrekne sa vzorka a potom čerpadlo, ktoré obsahuje vysoké množstvo tlaku, pomáha pohybovať vzorkou po naplnenej kolóne, kde sa rozdelí na jednotlivé zložky. Táto separácia sa potom analyzuje detektorom na získanie výsledkov.
Miesto vpichu
Aby bolo možné vstreknúť do HPLC, musí sa vzorka najskôr rozpustiť v polárnom kvapalnom rozpúšťadle, najlepšie v rozpúšťadle so známymi spektrami HPLC, aby bolo možné rozlíšiť jeho údaje od vzoriek. Kvapalný roztok obsahujúci vzorku sa vloží do prístroja a odošle sa do kolóny. Skutočné umiestnenie miesta vpichu závisí od značky nástrojov. Vo väčšine prípadov je proces injekcie automatizovaný, ale v niektorých prípadoch musí pracovník laboratória vstreknúť vzorku pomocou malej ihly injekčnej striekačky.
Komponent čerpadla
Čerpadlová zložka jednotky HPLC je nevyhnutná, pretože poskytuje tlak, ktorý poháňa vzorku cez kolónu. Sila čerpadla sa líši, ale výkonné môže vytvárať tlak až 6 000 psi alebo libier na štvorcový palec, ktorý sa aplikuje po vstreknutí vzorky. To umožňuje vzorke prechádzať kolónou rýchlejšie a efektívnejšie, ako keby odkvapkávala iba pomocou gravitačnej sily.
Popis stĺpca
Zvýšená rýchlosť vzorky prechádzajúcej kolónou pomocou čerpadla umožňuje použitie iného typu kolóny ako tých, ktoré sa používajú v jednoduchej kvapalinovej chromatografii. Výplňový materiál v kolóne môže mať oveľa menšiu veľkosť častíc, čo zvyšuje povrchovú plochu, a preto napomáha interakcii vzorky s kolónou. Väčšina HPLC kolón pracuje cez polaritu. Vzorka sa rozpustí v polárnom rozpúšťadle a kolóna sa skladá z veľkej časti z nepolárnych uhľovodíkov. Polárne časti molekuly vzorky prechádzajú kolónou veľmi rýchlo, pretože primárne interagujú s rozpúšťadlo, zatiaľ čo nepolárne zložky vzorky zotrvávajú v kolóne a vytvárajú slabé interakcie s kolónou komponenty. Preto komponenty vzorky odchádzajú zo stĺpca v poradí od najpolárnejších po najviac nepolárne.
Funkcia detektora
Detektory sa tiež líšia podľa typu použitého prístroja HPLC. Väčšina však funguje rovnakým základným spôsobom. Keď ultrafialové svetlo vychádza z kolóny, svieti na jednotlivé zložky vzorky. Väčšina organických zlúčenín absorbuje určité množstvo svetla, takže pri prechode okolo použitého svetelného lúča dokáže detektor zachytiť, koľko svetla sa absorbuje. Detektor tiež zaznamenáva retenčný čas komponentov na základe poradia, v akom vypadávajú zo stĺpca. Tento výstup je potom možné analyzovať na základe plochy píku, aby sa určila presná povaha zložiek vzorky.