Clonarea ADN: definiție, proces, exemple

Este posibil să clonezi organisme întregi, cum ar fi oaia Dolly, dar clonarea ADN-ului este diferită. Folosește tehnici de biologie moleculară pentru a face copii identice ale secvențelor ADN sau ale genelor individuale.

Folosind metode de inginerie genetică, segmente ale codului genetic ADN sunt identificate și izolate. Clonarea ADN-ului apoi copiază acid nucleic secvențe în segmente.

Copiile identice rezultate pot fi utilizate pentru cercetări suplimentare sau pentru aplicații de biotehnologie. Adesea gena care este copiată codifică o proteină care poate face parte din tratamentele medicale. Tehnologia ADN, inclusiv Clonarea ADN-ului susține înțelegerea modului în care funcționează genele și modul în care codul genetic al oamenilor influențează funcționarea corpului.

Clonarea ADN-ului este procesul de biologie moleculară de a face copii identice ale segmentelor de ADN situate în cromozomi care conțin codul genetic al organismelor avansate.

Procesul generează cantități mari de secvențe de ADN țintă. Scopul clonării ADN-ului este de a produce ele însele secvențele ADN țintă sau de a produce proteinele codificate în secvențele țintă.

Se numesc cele două metode utilizate în clonarea ADN-ului vector plasmid și reacție în lanț a polimerazei (PCR). În vector plasmid metoda, firele de ADN sunt tăiate folosind enzime de restricție pentru a produce fragmente de ADN, iar segmentele rezultate sunt inserate în vectori de clonare numiți plasmide pentru duplicare ulterioară. Plasmidele sunt plasate în celule bacteriene care produc apoi copii ADN sau proteine ​​codificate.

În Metoda PCR, segmentul catenelor de ADN care trebuie duplicat este marcat cu enzime numite grunduri. O enzimă polimerază face copii ale părții marcate a catenei ADN. Această metodă nu utilizează enzime de restricție și poate produce ADN clonat din probe mici. Uneori cele două metode de tehnologie ADN sunt utilizate împreună pentru a încorpora cele mai bune caracteristici ale fiecăruia într-o reacție generală.

Vectorul metodei se referă la plasmida utilizată pentru a menține segmentul de ADN țintă de clonat. Plasmidele sunt mici fire circulare de ADN necromozomial găsite în multe organisme, inclusiv bacterii și viruși.

Plasmidele bacteriene sunt vectorul utilizat pentru inserarea segmentului de ADN țintă în celulele bacteriene pentru duplicare ulterioară.

Selectarea și izolarea ADN-ului țintă: Înainte de începerea procesului de clonare a ADN-ului, trebuie identificate secvențele de ADN, în special începuturile și capetele segmentelor de ADN.

Astfel de secvențe de ADN pot fi găsite prin utilizarea ADN-ului clonat existent cu secvențe cunoscute sau prin studierea proteinei produse de secvența de ADN țintă. Odată ce secvența este cunoscută, pot fi utilizate enzimele de restricție corespunzătoare.

Tăierea ADN-ului țintă cu enzime de restricție: Enzimele de restricție sunt selectate pentru a căuta codul ADN la începutul și la sfârșitul secvențelor țintă.

Când enzimele de restricție găsesc o secvență specială codificată de perechi de baze numite site-uri de restricție, ele se atașează de ADN în acea locație și se înfășoară în jurul moleculei de ADN, întrerupând șuviță. Segmentele de ADN tăiate care conțin secvența țintă sunt acum disponibile pentru duplicare.

Alegerea vectorului plasmidic și inserarea ADN-ului țintă: O plasmidă adecvată conține în mod ideal aceleași secvențe de codificare ADN ca și catena de ADN din care a fost tăiat ADN-ul țintă. Catenă circulară de ADN a plasmidei este tăiată cu aceleași enzime de restricție ca și cele utilizate pentru tăierea ADN-ului țintă.

A Enzima ADN ligază este utilizat pentru a promova legarea segmentului ADN, iar capetele segmentului ADN țintă se leagă de capetele tăiate ale ADN-ului plasmidic. ADN-ul țintă face acum parte din catena de ADN plasmidic circular.

Introducerea plasmidei într-o celulă bacteriană: Odată ce plasmida conține secvența de ADN care trebuie clonată, clonarea efectivă poate avea loc folosind un proces numit transformare bacteriană. Plasmidele sunt inserate într-o celulă bacteriană, cum ar fi E. coli, iar celulele cu noile segmente de ADN vor începe să producă copii și proteinele corespunzătoare.

În transformarea bacteriană, celulele gazdă și plasmidele sunt incubate împreună la temperatura corpului timp de aproximativ 12 ore. Celulele absorb unele dintre plasmide și le tratează ca pe propriul lor ADN plasmidic.

Recoltarea ADN-ului și proteinelor clonate: Majoritatea plasmidelor utilizate pentru clonarea ADN au gene de rezistență la antibiotice încorporate în ADN-ul lor. Pe măsură ce celulele bacteriene absorb noile plasmide, ele devin rezistente la antibiotice.

Când cultura este tratată cu antibiotice, supraviețuiesc doar acele celule care au absorbit noile plasmide. Rezultatul este o cultură pură de celule bacteriene cu ADN clonat. Atunci ADN-ul poate fi recoltat sau proteina corespunzătoare poate fi produsă.

PCR metoda este mai simplă și copiază ADN-ul existent în loc. Nu necesită tăierea cu enzime de restricție sau introducerea plasmidăADN secvențe. Acest lucru îl face deosebit de potrivit pentru clonarea probelor de ADN cu un număr limitat de fire ADN. În timp ce metoda poate clona ADN-ul, nu poate fi utilizată pentru producerea proteinei corespunzătoare.

Desfășurarea firelor de ADN: ADN-ul din cromozomi este strâns înfășurat într-o structură cu dublă helix. Încălzirea ADN-ului la 96 de grade Celsius într-un proces numit denaturare face ca molecula ADN să se desfășoare și să se separe în două fire. Această separare este necesară deoarece doar o singură catenă de ADN poate fi clonată simultan.

Selectarea grundurilor: Ca și în cazul clonării ADN-ului cu plasmide vectoriale, secvențele de ADN care trebuie clonate trebuie identificate cu accent special pe începuturile și capetele segmentelor de ADN. Grundurile sunt enzime care se atașează la secvențe specifice de cod ADN și trebuie selectate pentru a marca segmentele de ADN țintă. Primerii corecți se vor atașa la secvențele moleculei de ADN pentru a marca începuturile și capetele segmentelor țintă.

Reacționarea reacției de legare a primerilor: Se numește răcirea reacției până la aproximativ 55 de grade Celsius recoacere. Pe măsură ce reacția se răcește, primerii sunt activați și se atașează la catena de ADN la fiecare capăt al unui segment de ADN țintă. Primerii acționează doar ca markeri, iar firul ADN nu trebuie tăiat.

Producerea de copii identice ale segmentului de ADN țintă: Într-un proces numit extensie, la reacție se adaugă enzima TAQ polimerază sensibilă la căldură. Reacția este apoi încălzită la 72 de grade Celsius, activând enzima. Enzima activă ADN polimerază se leagă de primeri și copiază secvența ADN între ele. Procesul inițial de secvențiere și clonare a ADN-ului este complet.

Creșterea randamentului de ADN clonat: Procesul inițial de recoacere și extindere creează relativ puține copii ale segmentelor de catenă de ADN disponibile. Pentru a crește randamentul prin replicarea suplimentară a ADN-ului, reacția este răcită din nou pentru a reactiva primerii și a le lăsa să se lege de alte fire ADN.

Apoi, reîncălzirea reacției activează din nou enzima polimerază și se produc mai multe copii. Acest ciclu poate fi repetat de 25 până la 30 de ori.

Metoda vectorului plasmidă se bazează pe o cantitate inițială amplă de ADN pentru tăiere și inserare în plasmide. Prea puțin ADN original are ca rezultat mai puține plasmide și un început lent al producției de ADN clonat.

Metoda PCR poate produce o cantitate mare de ADN din câteva fire ADN originale, dar deoarece ADN-ul nu este implantat într-o celulă bacteriană, producția de proteine ​​nu este posibilă.

Pentru a produce proteina codificată în fragmentele de ADN care urmează să fie clonate dintr-o mică probă inițială de ADN, cele două metode pot fi utilizate împreună și pot se completează reciproc. Mai întâi metoda PCR este utilizată pentru a clona ADN-ul dintr-o probă mică și pentru a produce multe copii.

Apoi, produsele PCR sunt utilizate cu metoda vectorului plasmidă pentru a implanta ADN-ul produs în celule bacteriene care vor produce proteina dorită.

Biologia moleculară folosește clonarea genelor și replicarea ADN în scopuri medicale și comerciale. Bacteriile cu secvențe de ADN clonate sunt utilizate pentru a produce medicamente și pentru a înlocui substanțe pe care persoanele cu tulburări genetice nu le pot produce singure.

Utilizările tipice includ:

• Gena pentru insulină umană este clonat în bacterii care produc apoi insulina utilizată de diabetici.
• Activatorul de plasminogen tisular este produs din ADN clonat și folosit pentru a ajuta preveni cheagurile de sânge.
• Hormonul de creștere uman poate fi produsă și administrată persoanelor care nu o pot produce singure.

Biotehnologia folosește, de asemenea, clonarea genelor în agricultură pentru a crea noi caracteristici la plante și animale sau pentru a spori caracteristicile existente. Pe măsură ce mai multe gene sunt clonate, numărul de utilizări posibile crește exponențial.

Moleculele de ADN alcătuiesc o mică parte din materialul dintr-o celulă vie și este dificil să se izoleze influențele multor gene. Metodele de clonare a ADN furnizează cantități mari dintr-o secvență specifică de ADN pentru studiu, iar ADN-ul produce proteine ​​la fel ca în celula originală. Clonarea ADN face posibilă studierea acestei operații pentru diferite gene în mod izolat.

Aplicațiile tipice de cercetare și tehnologie ADN includ examinarea:

• Funcția unei gene.
• Mutațiile unei gene.
• Expresia genelor.
• Produse genetice.
• Defecte genetice.

Când mai multe secvențe de ADN sunt clonate, este mai ușor să găsiți și să clonați secvențe suplimentare. Segmentele de ADN clonate existente pot fi utilizate pentru a determina dacă un segment nou se potrivește cu cel vechi și care părți sunt diferite. Identificarea unei secvențe de ADN țintă este apoi mai rapidă și mai precisă.

În terapia genică, o genă clonată este prezentată celulelor unui organism a cărui genă naturală este deteriorată. O genă vitală care produce o proteină necesară pentru o anumită funcție a organismului ar putea fi mutată, schimbată de radiații sau afectată de viruși.

Când gena nu funcționează corect, o substanță importantă lipsește din celulă. Terapia genică încearcă să înlocuiți gena cu o versiune clonată care va produce substanța necesară.

Terapia genică este încă experimentală și puțini pacienți au fost vindecați folosind tehnica. Problemele stau în identificarea unei singure gene responsabile de o afecțiune medicală și în livrarea a numeroase copii ale genei către celulele potrivite. Pe măsură ce clonarea ADN-ului a devenit mai răspândită, terapia genică a fost aplicată în mai multe situații specifice.

Aplicațiile recente de succes au inclus:

• Boala Parkinson: Folosind un virus ca vector, o genă legată de boala Parkinson a fost injectată în creierele mediane ale pacienților. Pacienții au experimentat abilități motorii îmbunătățite fără efecte secundare adverse.
• Deficiență de adenozin deaminază (ADA): O tulburare imunitară genetică a fost tratată prin îndepărtarea celulelor stem ale sângelui pacienților și prin inserarea genei ADA. Ca urmare, pacienții au reușit să producă cel puțin o parte din ADA.
• Hemofilie: Persoanele cu hemofilie nu produc proteine ​​specifice care ajută la formarea cheagurilor de sânge. O genă pentru producerea uneia dintre proteinele lipsă a fost inserată în celulele hepatice ale pacienților. Pacienții au produs proteina, iar incidentele de sângerare au fost reduse.

Terapia genică este una dintre cele mai promițătoare aplicații ale clonării ADN-ului, dar este posibil ca alte noi utilizări să prolifereze pe măsură ce sunt studiate mai multe secvențe de ADN și funcția lor este determinată. Clonarea ADN furnizează materia primă pentru ingineria genetică în cantitățile necesare.

Atunci când rolul genelor este cunoscut și funcționarea lor corectă poate fi asigurată prin înlocuirea defectelor genele, multe boli cronice și chiar cancerul pot fi atacate și tratate la nivel genetic folosind ADN tehnologie.

Continut Asemanator:

• Caracteristicile coloniei E.Coli (Escherichia Coli)
• ARN: Definiție, funcție, structură