În electroforeza pe gel, probele de ADN sau proteine sunt separate - de obicei în funcție de mărime - prin aplicarea unui câmp electric care le determină să migreze printr-un gel. Utilizarea electroforezei pe gel este de rutină în laboratoarele de cercetare biomedicală și este utilizată pentru a răspunde la o varietate de întrebări diferite, deci nu există cu adevărat un mod universal de a analiza rezultatele.
Diferite tehnici, cum ar fi Western blotting, Northern blotting și Southern blotting, de exemplu, implică toate electroforeză cu gel.
Dacă faci asta gel de agaroză electroforeza probelor de ADN, cel mai comun tip de procedură, de obicei va trebui să faceți cel puțin două lucruri: 1) distingeți netăiat plasmidele din inserții, plasmidele tăiate și plasmidele tăiate și, 2) estimează dimensiunea diferitelor fragmente de ADN cu o curbă standard Excel sau calculator.
Verificați caietul de laborator pentru a determina ce probe au fost încărcate pe ce benzi. Când ați încărcat godeurile pentru gel, ar fi trebuit să notați identitatea fiecărei benzi / probe.
Folosind o riglă, măsurați distanța pe imagine de la fântâni până la colorantul de urmărire, care va fi Am călătorit mai departe decât oricare dintre benzile ADN (cu alte cuvinte, va fi în partea de jos a gel). Înregistrați acest număr - unitățile pe care le utilizați nu sunt importante.
Măsurați distanța pe imagine de la fântâni la fiecare dintre benzile din "scară", apoi împărțiți distanța respectivă la distanța parcursă de colorant de urmărire grup. Acest calcul vă oferă mobilitatea relativă a fiecărei benzi.
Exemplu: Să presupunem că banda de colorare de urmărire a călătorit 6 inci și că avem trei benzi care au parcurs 5, 4,5 și 3,5 inci.
Care este mobilitatea lor relativă? Răspuns: Împărțim 5, 4.5 și 3.5 la 6 pentru a obține mobilități relative de 0.833, 0.75 și 0.5833.
Producătorul vă oferă dimensiunea fiecărui fragment din scările pe care le furnizează, deci ar trebui să aveți deja aceste informații.
Utilizați funcția Trendline din programul dvs. de calcul tabelar pentru a se potrivi cu o ecuație la date. Această ecuație ar trebui să fie o ecuație de putere (de exemplu, x ^ -2) și ar trebui să se potrivească relativ bine cu datele (coeficientul R de cel puțin 0,9). Aceasta creează o curbă și o curbă standard excela.
Amintiți-vă că fragmentele de ADN mai mici călătoresc mai departe prin gel decât fragmentele de ADN mari, astfel încât cele mai apropiate de colorantul de urmărire vor fi cele mai mici. Rețineți, totuși, că dacă plasmidă (circular) ADN-ul este netăiat, va deveni „supraînfășurat” sau răsucit ca un cablu telefonic, ceea ce îl va determina să călătorească mai departe decât ADN liniar de aceeași dimensiune.
La fel, o plasmidă „tăiată” care a fost tăiată incomplet va călători cu o mai scurt distanță decât ADN liniar de aceeași dimensiune. În consecință, nu puteți estima dimensiunea plasmidelor netăiate din gel.
Potriviți benzile din fiecare bandă cu identitatea eșantionului pe care l-ați încărcat pe banda respectivă și stabiliți dacă ceea ce vedeți este ceea ce v-ați fi așteptat. Acest lucru va depinde de natura experimentului dvs.
În general, totuși, dacă ați digerat o plasmidă de inserție cu două enzime de restricție, v-ați aștepta ca inserția să fie eliberată de plasmidă.
Deoarece este mult mai mic decât plasmida, v-ați aștepta să vedeți două benzi în acea bandă, una lângă partea de sus și cealaltă în jos, lângă partea de jos. O plasmidă tăiată cu o singură enzimă de restricție ar trebui să formeze doar o singură bandă care se deplasează puțin mai departe decât plasmida tăiată cu două enzime de restricție, dar nici pe departe până la insert.
Măsurați distanța de la fântâni la plasmida tăiată și introduceți benzi cu rigla. Împărțiți aceste numere la distanța parcursă de colorantul de urmărire pentru a găsi mobilitatea relativă a inserțiilor și a plasmidelor tăiate.