Avantajele și dezavantajele Western Blot

Western blot, o tehnică analitică utilizată pentru a identifica o proteină specifică într-o probă dată, folosește capacitatea unei enzime sau a unui anticorp primar marcat cu fluorescență de a se lega de antigenul său specific. Este un proces în trei etape care începe cu electroforeza pe gel, urmat de blotarea membranei și sondarea cu anticorpi. Detectarea proteinelor poate fi directă sau indirectă, acesta din urmă utilizând un anticorp secundar marcat îndreptat împotriva primarului. Deși acceptată ca tehnică de analiză de rutină a proteinelor, western blot are limitări, precum și beneficii.

Unul dintre cele mai mari argumente în favoarea western blot este sensibilitatea sa. Datorită capacității sale de a detecta doar 0,1 nanograme de proteine ​​într-o probă, tehnica poate servi teoretic un instrument eficient de diagnostic precoce, care detectează chiar și cel mai mic răspuns imunogen de la un virus sau bacterie la un pacient probă. Un western blot indirect se bazează în continuare pe această sensibilitate din capacitatea anticorpului secundar de a amplifica intensitatea semnalului detectat de sistemul de imagistică. Sensibilitate mai mare înseamnă că sunt necesari mai puțini anticorpi pentru testare, ceea ce reduce semnificativ costurile de laborator.

Tehnica western blot își datorează specificitatea doi mari factori care contribuie. În primul rând, electroforeza pe gel sortează o probă în proteine ​​de dimensiuni, sarcini și conformație diferite. Acest proces în sine este un pas uriaș spre detectare, deoarece benzile formate în gel dau deja indicii despre mărimea proteinei sau polipeptidei de interes. Specificitatea interacțiunii anticorp-antigen servește ca al doilea factor important. Deoarece anticorpii specifici prezintă afinitate pentru anumite proteine, procesul poate detecta selectiv o proteină țintă chiar și într-un amestec de 300.000 de proteine ​​diferite.

În ciuda sensibilității și specificității sale, un western blot poate produce în continuare rezultate eronate. Un rezultat fals pozitiv rezultă atunci când un anticorp reacționează cu o proteină neintenționată, ceea ce este frecvent se întâmplă atunci când un pacient care este testat pentru HIV se întâmplă să aibă tuberculoză sau un număr de paraziți infecții. Un fals negativ, pe de altă parte, poate rezulta cu ușurință dacă proteinelor mai mari nu li se acordă suficient timp pentru a se transfera corect la membrană. Ștergerea și procesarea necorespunzătoare produc adesea benzi înclinate, decolorate sau chiar multiple, făcând rezultatele testelor supuse interpretării tehnicianului.

Costul unui western blot este un compozit din cheltuielile individuale mari pentru anticorpii etichetați, analiști calificați și echipamente de laborator. Un proces delicat, Western Bloting necesită precizie în fiecare etapă pentru identificarea corectă a constituenților eșantionului. O eroare minoră în concentrația reactivului sau în perioada de incubație poate fi dezastruoasă pentru întregul proces. În cele din urmă, echipamentele necesare pentru detectare și imagistică - sisteme de detectare chemiluminiscente, fluorescente, radioactive sau cu laser - pot fi prea scumpe pentru unitatea medie de microbiologie.