Avantajele utilizării enzimelor Sticky End

Clonarea moleculară este o metodă comună de biotehnologie pe care fiecare student și cercetător ar trebui să o cunoască. Clonarea moleculară utilizând un tip de enzimă numită enzimă de restricție pentru a tăia ADN-ul uman în fragmente care pot fi apoi inserate în ADN-ul plasmidic al unei celule bacteriene. Enzimele de restricție reduc ADN-ul dublu catenar în jumătate. În funcție de enzima de restricție, tăierea poate avea ca rezultat fie un capăt lipicios, fie un capăt contondent. Capetele lipicioase sunt mai utile în clonarea moleculară, deoarece asigură faptul că fragmentul de ADN uman este introdus în plasmidă în direcția corectă. Procesul de ligare sau fuzionarea fragmentelor de ADN necesită mai puțin ADN atunci când ADN-ul are capete lipicioase. În cele din urmă, mai multe enzime de restricție lipicioase pot produce același cap lipicios, chiar dacă fiecare enzimă recunoaște o secvență de restricție diferită. Acest lucru crește probabilitatea ca regiunea de interes a ADN-ului dvs. să poată fi tăiată de enzimele finale lipicioase.

Enzimele de restricție sunt enzime care taie recunosc secvențe specifice pe ADN dublu catenar și taie ADN-ul în jumătate la acea secvență. Secvența recunoscută se numește situl de restricție. Enzimele de restricție sunt numite endonucleaze, deoarece taie ADN-ul dublu catenar, care este modul în care ADN-ul există în mod normal, în locații care se află între capetele ADN-ului. Există mai mult de 90 de enzime de restricție diferite. Fiecare recunoaște un site de restricție distinct. Enzimele de restricție își scindează siturile de restricție respective de 5.000 de ori mai eficient decât alte site-uri pe care nu le recunosc.

Enzimele de restricție vin în două clase generale. Ori taie ADN-ul în capete lipicioase sau capete contondente. Un capăt lipicios are o regiune scurtă de nucleotide, blocurile de construcție ale ADN-ului, care este nepereche. Această regiune nepereche se numește o surplus. Se spune că surplombul este lipicios, deoarece vrea și se va împerechea cu un alt capăt lipicios care are o secvență complementară de depășire. Capetele lipicioase sunt ca niște gemeni pierduți de mult care doresc să se îmbrățișeze strâns odată ce se întâlnesc. Pe de altă parte, capetele contondente nu sunt lipicioase, deoarece toate nucleotidele sunt deja împerecheate între cele două catene de ADN. Avantajul capetelor lipicioase este că un fragment de ADN uman nu poate încapea decât într-o plasmidă bacteriană într-o singură direcție. În schimb, dacă atât ADN-ul uman cât și plasmida bacteriană au capete contondente, ADN-ul uman poate fi introdus cap-la-coadă sau coadă-la-cap în plasmidă.

Deși ADN-ul cu capete lipicioase se găsește mai ușor din cauza „lipiciosului” lor, nici capetele lipicioase, nici capetele contondente nu pot fuziona împreună într-o bucată continuă de ADN. Formarea unei bucăți continue de ADN care este complet legată necesită o enzimă numită ligază. Ligazele conectează coloana vertebrală a nucleotidelor la capetele lipicioase sau contondente, rezultând un lanț continuu de nucleotide. Deoarece capetele lipicioase se găsesc mai repede datorită atracției lor unul față de celălalt, procesul de ligatură necesită mai puțin ADN uman și mai puțin ADN plasmidic. Capetele contondente ale ADN-ului și plasmidele sunt mai puțin susceptibile de a se găsi reciproc și, prin urmare, ligarea capetelor contondente necesită introducerea mai multor ADN în eprubetă.

Siturile de restricție sunt situate în întregul genom al organismelor, dar nu sunt distanțate uniform. În plasmide, acestea pot fi proiectate pentru a fi situate una lângă alta. Oamenii de știință care doresc să taie un fragment de ADN uman din genomul uman trebuie să găsească situri de restricție care se află în fața și în spatele regiunii fragmentului. Pe lângă asigurarea faptului că un fragment de ADN este introdus în direcția corectă, diferite enzime de capăt lipicios pot crea același capăt lipicios, chiar dacă recunosc secvențe de restricție diferite. De exemplu, BamHI, BglII și Sau3A au secvențe de recunoaștere diferite, dar produc același capăt lipicios GATC. Acest lucru crește probabilitatea ca vor exista site-uri de restricție lipicioase care să flanceze gena umană de interes.