Tris, sau tris (hidroximetil) aminometan, este un tampon biologic comun, utilizat pe tot parcursul procesului de extracție a ADN-ului. În timpul extracției din orice număr de surse, ADN-ul este sensibil la pH. În timpul lizei celulare, îndepărtarea componentelor celulare nedorite și precipitații, tris este utilizat pentru a menține un pH stabil. În plus, joacă un rol deosebit de important în liza celulară.
TL; DR (Prea lung; Nu am citit)
Extracția ADN este un proces sensibil la pH și utilizarea unui tampon tris ajută la menținerea pH-ului stabil în timpul lizei și extracției celulare.
Tris ca tampon
Deoarece pH-ul poate influența și fi influențat de o serie de factori celulari, menținerea unui pH stabil este esențială pentru știința experimentală. Tampoanele biologice, cum ar fi tris, sunt importante deoarece pot menține un pH stabil în ciuda influențelor care altfel ar putea schimba pH-ul. Tris (hidroximetil) aminometanul, cu un pKa de 8,1, este un tampon eficient între pH 7 și 9. Datorită intervalului său neutru, tris este un tampon utilizat în mod obișnuit în laboratoarele biologice. Cu toate acestea, tamponul tris este sensibil la temperatură și trebuie utilizat la temperatura la care a fost inițial pH-ul pentru a evita inexactitatea.
Liza celulelor
Liza, sau deschiderea celulelor, este primul pas al extracției ADN-ului. Acest lucru se realizează printr-un tampon care conține tris și EDTA (acid etilendiaminetetraacetic). EDTA leagă cationii divalenți precum calciu și magneziu. Deoarece acești ioni contribuie la menținerea integrității membranei celulare, eliminarea lor cu EDTA destabilizează membrana. Tris este componenta principală de tamponare; rolul său principal este de a menține pH-ul tamponului într-un punct stabil, de obicei 8,0. În plus, tris probabil interacționează cu LPS (lipopolizaharida) din membrană, servind la destabilizarea membranei mai departe.
Tris Protejează ADN-ul de deplasările pH-ului
Când celulele sunt rupte, ADN-ul și conținutul lor se revarsă în tampon. În plus, RNaza A (distruge ARN), proteazele (distruge proteinele) și SDS (dodecil sulfat de sodiu, solubilizează fragmentele de membrană) sunt adesea incluse. Luată împreună, această supă de conținut celular și ARN fragmentat și proteine poate avea un impact mare asupra pH-ului soluției. Deoarece ADN-ul este sensibil la pH, este important ca tris să tamponeze supa și să mențină pH-ul la un punct stabil.
Precipitații ADN
În etapa finală a extracției ADN-ului, ADN-ul în sine este extras din soluție. În acest moment, ADN-ul este solubil în tampon. Pentru a extrage din soluție, ADN-ul se face insolubil prin adăugarea de etanol sau izopropanol (alcool izopropilic). Când se face acest lucru, ADN-ul devine evident în soluție ca o substanță albă. Deși ADN-ul poate fi izolat în acest mod de componentele celulare rămase, acesta nu este „utilizabil” atunci când este insolubil. După izolare, alcoolul este îndepărtat și ADN-ul trebuie returnat într-un tampon biologic, cum ar fi tris, pentru a fi utilizat.
Fă-o singur
Deși extracția ADN-ului se face în mod obișnuit în laboratoarele de cercetare, folosind în general unul dintre un număr de kituri disponibile comercial, oricine poate face extracția ADN-ului acasă folosind obiecte obișnuite de uz casnic și verde mazăre sau spanac. În acest caz, tris și nici un tampon biologic nu este prezent pentru a proteja ADN-ul de schimbările de pH. Cu toate acestea, este un mod vizual de a ajuta elevii să se conecteze cu ADN celular.