Qual é a primeira etapa de uma reação em cadeia da polimerase?

A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica que fotocopia um fragmento de DNA em muitos fragmentos - exponencialmente muitos. O primeiro passo na PCR é aquecer o DNA para que se desnature ou derreta em fitas simples. A estrutura do DNA é como uma escada de corda em que os degraus são cordas com extremidades magnéticas. Os ímãs se conectam para formar os degraus, chamados de pares de bases, e assim resistem à separação. Cada fragmento de DNA se funde em fitas simples em diferentes temperaturas. Compreender como a estrutura do DNA é mantida unida pelas partes individuais do DNA dará uma ideia do porquê diferentes fragmentos de DNA derretem em diferentes temperaturas e por que essas altas temperaturas são necessárias no primeiro Lugar, colocar.

A primeira etapa da PCR é derreter o DNA para que o DNA de fita dupla se separe em DNA de fita simples. Para o DNA de mamíferos, esta primeira etapa geralmente envolve uma temperatura de aproximadamente 95 graus Celsius (cerca de 200 Fahrenheit). Nessa temperatura, as ligações de hidrogênio entre os pares de bases A-T e G-C, ou degraus na escada do DNA, se separam, descompactando o DNA de fita dupla. No entanto, a temperatura não é alta o suficiente para quebrar a espinha dorsal do açúcar fosfato que forma os fios simples, ou os postes da escada. A separação completa das fitas simples os prepara para a segunda etapa da PCR, que é o resfriamento para permitir que fragmentos curtos de DNA, chamados de primers, se liguem às fitas simples.

Um dos motivos pelos quais o DNA é aquecido à alta temperatura de 95 graus Celsius é que quanto mais longa a fita dupla de DNA, mais ela deseja permanecer unida. O comprimento do DNA é um fator que afeta o ponto de fusão escolhido para a PCR naquele pedaço de DNA. Os pares de bases A-T e G-C na ligação de DNA de fita dupla entre si para manter a estrutura de fita dupla unida. Quanto mais pares de bases consecutivas entre duas fitas simples se ligam, mais seus vizinhos também querem se ligar e mais forte se torna a atração entre as duas fitas. É como um zíper feito de pequenos ímãs. Conforme você fecha o zíper, os ímãs naturalmente querem fechar e permanecer fechados.

Outro fator que afeta a temperatura de fusão a ser escolhida para o fragmento de DNA de interesse é a quantidade de pares de bases G-C presentes nesse fragmento. Cada par de bases é como dois mini-ímãs que se atraem. Um par feito de G e C é muito mais fortemente atraído do que um par A e T. Assim, um pedaço de DNA que tem mais pares G-C do que outro fragmento exigirá uma temperatura mais alta antes de se fundir em fitas simples. O DNA absorve naturalmente a luz ultravioleta - no comprimento de onda de 260 nanômetros, para ser exato - e o DNA de fita simples absorve mais luz do que o DNA de fita dupla. Portanto, medir a quantidade de luz absorvida é uma forma de medir o quanto o DNA de fita dupla se fundiu em fitas simples. O efeito de "zíper magnético" dos pares de bases G-C e A-T é o que causa um gráfico da absorção de luz de DNA de fita dupla plotado contra um aumento na temperatura para ser sigmoidal, com a forma de um S, e não de um linha reta. A curva do S representa a resistência do trabalho em equipe que os pares de bases exercem contra o calor porque eles não querem se separar.

A temperatura na qual um comprimento de DNA se funde em fitas simples é chamada de temperatura de fusão, que é indicada pela abreviatura "Tm". Isso indica a temperatura na qual metade do DNA em uma solução se fundiu em fitas simples e a outra metade ainda está em fita dupla Formato. A temperatura de fusão é diferente para cada fragmento de DNA. O DNA de mamífero tem um conteúdo de G-C de 40%, o que significa que os 60% restantes dos pares de bases são As e Ts. Seu conteúdo de 40% de G-C faz com que o DNA dos mamíferos derreta a 87 graus Celsius (cerca de 189 Fahrenheit). É por isso que a primeira etapa da PCR no DNA de mamíferos é aquecê-lo a 94 graus Celsius (201 Fahrenheit). Apenas sete graus mais quente do que a temperatura de fusão e todas as fitas duplas se derreterão completamente em fitas simples.