Clonagem de DNA: Definição, Processo, Exemplos

É possível clonar organismos inteiros, como a ovelha Dolly, mas a clonagem de DNA é diferente. Ele usa técnicas de biologia molecular para fazer cópias idênticas de sequências de DNA ou genes únicos.

Usando métodos de engenharia genética, segmentos do código genético do DNA são identificados e isolados. A clonagem de DNA, em seguida, copia o ácido nucleico sequências nos segmentos.

As cópias idênticas resultantes podem ser usadas para pesquisas futuras ou para aplicações de biotecnologia. Freqüentemente, o gene copiado codifica uma proteína que pode fazer parte de tratamentos médicos. Tecnologia de DNA incluindo Clonagem de DNA está apoiando a compreensão de como os genes funcionam e como o código genético dos humanos influencia o funcionamento do corpo.

A clonagem de DNA é o processo de biologia molecular de fazer cópias idênticas de segmentos de DNA localizados nos cromossomos que contêm o código genético de organismos avançados.

O processo gera grandes quantidades de

Os dois métodos usados ​​na clonagem de DNA são chamados vetor de plasmídeo e reação em cadeia da polimerase (PCR). No vetor de plasmídeo método, fitas de DNA são cortadas usando Enzimas de restrição para produzir fragmentos de DNA, e os segmentos resultantes são inseridos em vetores de clonagem chamados plasmídeos para duplicação posterior. Os plasmídeos são colocados em células bacterianas que então produzem as cópias de DNA ou proteínas codificadas.

No Método PCR, o segmento de fitas de DNA a ser duplicado é marcado com enzimas chamadas primers. Uma enzima polimerase faz cópias da parte marcada da fita de DNA. Este método não usa enzimas de restrição e pode produzir DNA clonado a partir de pequenas amostras. Às vezes, os dois métodos de tecnologia de DNA são usados ​​juntos para incorporar as melhores características de cada um em uma reação geral.

O vetor do método refere-se ao plasmídeo usado para conter o segmento de DNA alvo a ser clonado. Os plasmídeos são pequenos filamentos circulares de DNA não cromossômico encontrado em muitos organismos, incluindo bactérias e vírus.

Os plasmídeos bacterianos são o vetor usado para inserir o segmento de DNA alvo nas células bacterianas para posterior duplicação.

Selecionando e isolando o DNA alvo: Antes que o processo de clonagem de DNA possa começar, as sequências de DNA devem ser identificadas, especialmente o início e o fim dos segmentos de DNA.

Essas sequências de DNA podem ser encontradas usando DNA clonado existente com sequências conhecidas ou estudando a proteína produzida pela sequência de DNA alvo. Uma vez que a sequência é conhecida, as enzimas de restrição correspondentes podem ser usadas.

Cortando o DNA alvo com enzimas de restrição: As enzimas de restrição são selecionadas para procurar o código de DNA no início e no final das sequências alvo.

Quando as enzimas de restrição encontram uma sequência codificada especial de pares de bases chamados sítios de restrição, eles anexam-se ao DNA naquele local e enrolam-se em torno da molécula de DNA, cortando o vertente. Os segmentos de DNA cortados contendo a sequência alvo agora estão disponíveis para duplicação.

Escolhendo o vetor de plasmídeo e inserindo o DNA alvo: Um plasmídeo adequado contém idealmente as mesmas sequências de codificação de DNA que a cadeia de DNA da qual o DNA alvo foi cortado. A cadeia circular de DNA do plasmídeo é cortada com as mesmas enzimas de restrição que foram utilizadas para cortar o DNA alvo.

UMA Enzima DNA ligase é usado para promover a ligação do segmento de DNA, e as extremidades do segmento de DNA alvo se ligam às extremidades cortadas do DNA do plasmídeo. O DNA alvo agora faz parte da fita circular de DNA do plasmídeo.

Inserindo o plasmídeo em uma célula bacteriana: Uma vez que o plasmídeo contenha a sequência de DNA a ser clonada, a clonagem real pode ocorrer usando um processo denominado transformação bacteriana. Os plasmídeos são inseridos em uma célula bacteriana, como E. coli, e as células com os novos segmentos de DNA começarão a produzir cópias e as proteínas correspondentes.

Na transformação bacteriana, as células hospedeiras e os plasmídeos são incubados juntos à temperatura corporal por cerca de 12 horas. As células absorvem alguns dos plasmídeos e os tratam como seu próprio DNA de plasmídeo.

Colher o DNA clonado e proteínas: A maioria dos plasmídeos usados ​​para clonagem de DNA tem genes de resistência a antibióticos incorporados em seu DNA. À medida que as células bacterianas absorvem os novos plasmídeos, elas se tornam resistentes aos antibióticos.

Quando a cultura é tratada com antibióticos, apenas as células que absorveram os novos plasmídeos sobrevivem. O resultado é uma cultura pura de células bacterianas com DNA clonado. Esse DNA pode então ser colhido ou a proteína correspondente pode ser produzida.

O PCR método é mais simples e copia o DNA existente no local. Não requer corte com enzimas de restrição ou inserção plasmídeoDNA sequências. Isso o torna especialmente adequado para clonar amostras de DNA com um número limitado de fitas de DNA. Embora o método possa clonar DNA, ele não pode ser usado para a produção da proteína correspondente.

Desenrolando as fitas de DNA: O DNA nos cromossomos é fortemente enrolado em uma estrutura de dupla hélice. Aquecer o DNA a 96 graus Celsius em um processo chamado desnaturação faz a molécula de DNA se desenrolar e se separar em duas fitas. Essa separação é necessária porque apenas uma única fita de DNA pode ser clonada de cada vez.

Selecionando os primers: Tal como acontece com a clonagem de DNA de vetor de plasmídeo, as sequências de DNA a serem clonadas devem ser identificadas com ênfase especial no início e no fim dos segmentos de DNA. Os primers são enzimas que se ligam a sequências de código de DNA específicas e devem ser selecionados para marcar os segmentos de DNA alvo. Os primers corretos serão anexados às sequências da molécula de DNA para marcar o início e o fim dos segmentos alvo.

Recozendo a reação para ligar os primers: Resfriar a reação até cerca de 55 graus Celsius é chamado anelamento. À medida que a reação esfria, os primers são ativados e se fixam à fita de DNA em cada extremidade de um segmento de DNA alvo. Os primers atuam apenas como marcadores, e a fita de DNA não precisa ser cortada.

Produzindo cópias idênticas do segmento de DNA alvo: Em um processo chamado extensão, a enzima polimerase TAQ sensível ao calor é adicionada à reação. A reação é então aquecida a 72 graus Celsius, ativando a enzima. A enzima DNA polimerase ativa se liga aos primers e copia a sequência de DNA entre eles. O processo inicial de sequenciação e clonagem de DNA está completo.

Aumentando o rendimento do DNA clonado: O processo inicial de recozimento e extensão cria relativamente poucas cópias dos segmentos de fita de DNA disponíveis. Para aumentar o rendimento por meio de replicação adicional de DNA, a reação é resfriada novamente para reativar os primers e deixá-los se ligarem a outras fitas de DNA.

Então, o reaquecimento da reação ativa a enzima polimerase novamente e mais cópias são produzidas. Este ciclo pode ser repetido de 25 a 30 vezes.

O método do vetor plasmídeo se baseia em um amplo suprimento inicial de DNA para cortar e inserir nos plasmídeos. Muito pouco DNA original resulta em menos plasmídeos e um início lento para a produção de DNA clonado.

O método de PCR pode produzir uma grande quantidade de DNA a partir de poucas fitas originais de DNA, mas como o DNA não está implantado em uma célula bacteriana, a produção de proteínas não é possível.

Para produzir a proteína codificada nos fragmentos de DNA a serem clonados a partir de uma pequena amostra de DNA inicial, os dois métodos podem ser usados ​​juntos, e eles podem se completam. Primeiro, o método de PCR é usado para clonar o DNA de uma pequena amostra e produzir muitas cópias.

Em seguida, os produtos de PCR são usados ​​com o método de vetor de plasmídeo para implantar o DNA produzido em células bacterianas que irão produzir a proteína desejada.

A biologia molecular usa clonagem de genes e replicação de DNA para fins médicos e comerciais. As bactérias com sequências de DNA clonadas são usadas para produzir medicamentos e substituir substâncias que as pessoas com doenças genéticas não podem produzir.

Os usos típicos incluem:

• O gene para insulina humana é clonado em bactérias que produzem a insulina usada pelos diabéticos.
• O ativador do plasminogênio tecidual é produzido a partir de DNA clonado e usado para ajudar prevenir coágulos de sangue.
• Hormônio de crescimento humano pode ser produzido e administrado a pessoas que não podem produzi-lo sozinhas.

A biotecnologia também usa a clonagem de genes na agricultura para criar novas características em plantas e animais ou aprimorar características existentes. À medida que mais genes são clonados, o número de usos possíveis aumenta exponencialmente.

As moléculas de DNA constituem uma pequena fração do material em uma célula viva e é difícil isolar as influências de muitos genes. Os métodos de clonagem de DNA entregam grandes quantidades de uma sequência específica de DNA para estudo, e o DNA está produzindo proteínas exatamente como fazia na célula original. A clonagem de DNA permite estudar esta operação para diferentes genes de forma isolada.

As aplicações típicas de pesquisa e tecnologia de DNA incluem o exame de:

• Função de um gene.
• Mutações de um gene.
• Expressão genetica.
• Produtos genéticos.
• Defeitos genéticos.

Quando mais sequências de DNA são clonadas, é mais fácil encontrar e clonar sequências adicionais. Os segmentos de DNA clonados existentes podem ser usados ​​para determinar se um novo segmento corresponde ao antigo e quais partes são diferentes. Identificar uma sequência de DNA alvo é então mais rápido e preciso.

Dentro terapia de genes, um gene clonado é apresentado às células de um organismo cujo gene natural está danificado. Um gene vital que produz uma proteína necessária para a função de um organismo específico pode ser mutado, alterado por radiação ou afetado por vírus.

Quando o gene não funciona corretamente, uma substância importante está faltando na célula. A terapia genética tenta substitua o gene por uma versão clonada que irá produzir a substância necessária.

A terapia gênica ainda é experimental e poucos pacientes foram curados com a técnica. Os problemas residem em identificar o único gene responsável por uma condição médica e entregar muitas cópias do gene às células certas. À medida que a clonagem de DNA se tornou mais difundida, a terapia gênica foi aplicada em várias situações específicas.

As aplicações recentes bem-sucedidas incluíram:

• Mal de Parkinson: Usando um vírus como vetor, um gene relacionado à doença de Parkinson foi injetado no mesencéfalo dos pacientes. Os pacientes experimentaram melhora nas habilidades motoras sem quaisquer efeitos colaterais adversos.
• Deficiência de adenosina desaminase (ADA): Um distúrbio imunológico genético foi tratado removendo as células-tronco do sangue dos pacientes e inserindo o gene ADA. Como resultado, os pacientes foram capazes de produzir pelo menos parte de seu próprio ADA.
• Hemofilia: Pessoas com hemofilia não produzem proteínas específicas que ajudam a coagular o sangue. Um gene para a produção de uma das proteínas ausentes foi inserido nas células do fígado dos pacientes. Os pacientes produziram a proteína e os incidentes de sangramento foram reduzidos.

A terapia gênica é uma das aplicações mais promissoras da clonagem de DNA, mas outros novos usos provavelmente se proliferarão à medida que mais sequências de DNA forem estudadas e sua função determinada. A clonagem de DNA fornece a matéria-prima para a engenharia genética nas quantidades necessárias.

Quando o papel dos genes é conhecido e sua função adequada pode ser assegurada por meio da substituição de defeitos genes, muitas doenças crônicas e até câncer podem ser atacados e tratados em nível genético usando DNA tecnologia.

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