Eletroforese em gel é uma técnica de laboratório comumente usada com muitas aplicações práticas, incluindo impressão digital de DNA e sequenciamento de genoma. O processo envolve separar DNA fragmentos usando uma corrente elétrica enquanto rastreia a taxa de movimento molecular através de um gel de filtragem.
Adicionar corante de rastreamento azul ou laranja a amostras de DNA incolores permite que você veja sua amostra e obtenha informações sobre como as moléculas de DNA se movem durante a eletroforese. A identificação é baseada no tamanho das bandas de DNA no gel após a migração das moléculas.
Como funciona a eletroforese em gel
Eletroforese em gel puxa fragmentos de DNA através de um gel usando uma corrente elétrica para isolar e identificar moléculas de DNA por tamanho e carga elétrica. O gel geralmente é feito com pó de agarose - um polissacarídeo extraído de algas marinhas.
A agarose é adicionada a uma solução tampão de água e sal, e a mistura é aquecida e resfriada para formar um gel poroso que atuará como uma matriz de filtragem durante o procedimento de eletroforese. O gel é então colocado em uma unidade de eletroforese e coberto com solução tampão que conduz
Soluções contendo DNA e corantes de carga são pipetadas em pequenos poços no gel que devem ser feitos durante a preparação do gel. Tinturasajudar vocêveja claramente a amostra que você está adicionando aos poços de gel localizados próximos ao eletrodo negativo da unidade de eletroforese.
Um eletrodo positivo está localizado na extremidade oposta. Um padrão conhecido de fragmentos de DNA é colocado no primeiro poço que criará uma escada de bandas de DNA para fins de comparação e identificação.
A estrutura de fosfato das moléculas de DNA dá ao DNA uma carga negativa. Os opostos se atraem, conseqüentemente, as moléculas de DNA são atraídas para o eletrodo positivo e começam a se mover, ou “migrar”, quando uma corrente elétrica é ligada.
Fragmentos de DNA menores viajam mais rápido do que fragmentos maiores porque encontram menos resistência à medida que migram através da matriz porosa do gel. Fragmentos de DNA de tamanho semelhante formam bandas de DNA no gel.
Objetivo e Importância do Carregamento da Tintura
O DNA é incolor, então adicionando tinturas de rastreamento a uma amostra ajuda você determinar a taxa de movimento de moléculas de proteínas de tamanhos diferentes no gel durante a eletroforese. Exemplos de carregamento de corantes que se movem com a amostra de DNA incluem bromofenolazul e xileno cianol.
O corante escolhido não deve ser reativo ou alterar o DNA. O azul de bromofenol é um corante usado para rastrear fitas de DNA menores contendo cerca de 400 pares de bases, enquanto o xileno cianol é melhor para fitas de DNA maiores com até 8.000 pares de bases. O corante escolhido não deve ser reativo ou alterar o DNA.
Papel do glicerol na eletroforese em gel de agarose
Ao preparar sua amostra de DNA para eletroforese, você precisará adicionar glicerol e água junto com os corantes de carregamento. O glicerol é uma substância pesada e xaroposa que dá mais densidade à amostra de DNA antes que ela seja inserida nos poços de uma das extremidades da folha de gel.
Sem glicerol, a amostra de DNA se dispersaria em vez de afundar e formar uma camada no poço, como deveria fazer para formar uma escada de DNA.
Rastreamento de tinta em SDS PAGE
A eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida (SDS PAGE) é uma técnica adequada para separar proteínas e aminoácidos, que são menores e mais complexos do que as moléculas lineares de DNA. A poliacrilamida (gel SDS PAGE) é usada em vez do gel de agarose para eletroforese.
Azul de bromofenol (BPB) é adicionado ao tampão de amostra como um tinta de rastreamento que se move na mesma direção de separar proteínas e demarcar sua borda de ataque.
Papel do corante de ligação ao DNA
Corante de ligação a DNA, como cor de laranja o brometo de etídio pode ser adicionado ao gel ou ao tampão de eletroforese. Como o nome sugere, o corante se liga à molécula de DNA.
Deve-se tomar muito cuidado ao manusear esse corante mutagênico, pois ele pode se ligar ao DNA das células da pele. Ao contrário dos corantes de rastreamento, brometo de etídio fluorescentes brilhantemente sob luz UV, tornando as bandas de DNA visíveis.