Vantagens e desvantagens do Western Blot

Western blot, uma técnica analítica usada para localizar uma proteína específica em uma determinada amostra, emprega a capacidade de uma enzima ou anticorpo primário marcado com fluorescência para se ligar ao seu antígeno específico. É um processo de três etapas, começando com eletroforese em gel, seguido por blotting da membrana e sondagem com anticorpos. A detecção de proteínas pode ser direta ou indireta, com a última usando um anticorpo secundário marcado direcionado contra o primário. Embora aceito como uma técnica de análise de proteína de rotina, o western blot tem limitações e também benefícios.

Um dos maiores argumentos a favor do western blot é sua sensibilidade. Devido à sua capacidade de detectar apenas 0,1 nanograma de proteína em uma amostra, a técnica pode teoricamente servir como uma ferramenta de diagnóstico precoce eficaz, detectando até mesmo a menor resposta imunogênica de um vírus ou bactéria em um paciente amostra. Um western blot indireto aumenta ainda mais essa sensibilidade a partir da capacidade do anticorpo secundário de amplificar a intensidade do sinal detectado pelo sistema de imagem. Maior sensibilidade significa que menos anticorpos são necessários para o teste, o que reduz significativamente os custos laboratoriais.

A técnica do western blot deve sua especificidade a dois grandes fatores contribuintes. Primeiro, a eletroforese em gel classifica uma amostra em proteínas de diferentes tamanhos, cargas e conformações. Esse processo em si é um grande passo para a detecção, pois as bandas formadas no gel já fornecem pistas sobre o tamanho da proteína ou polipeptídeo de interesse. A especificidade da interação anticorpo-antígeno serve como o segundo grande fator. Como os anticorpos específicos mostram afinidade por proteínas específicas, o processo pode detectar seletivamente uma proteína alvo, mesmo em uma mistura de 300.000 proteínas diferentes.

Apesar de sua sensibilidade e especificidade, um western blot ainda pode produzir resultados errôneos. Um falso-positivo resulta quando um anticorpo reage com uma proteína não pretendida, que é o que frequentemente acontece quando um paciente que está sendo testado para HIV tem tuberculose ou uma série de doenças parasitárias infecções. Um falso negativo, por outro lado, pode resultar facilmente se proteínas maiores não tiverem tempo suficiente para se transferirem adequadamente para a membrana. O blotting e o processamento incorretos geralmente produzem bandas distorcidas, desbotadas ou mesmo múltiplas, tornando os resultados dos testes sujeitos à interpretação do técnico.

O custo de um western blot é um composto das grandes despesas individuais com anticorpos marcados, analistas qualificados e equipamento de laboratório. Um processo delicado, o western blotting requer precisão em todas as etapas para a identificação adequada dos constituintes de uma amostra. Um pequeno erro na concentração do reagente ou no período de incubação pode ser desastroso para todo o processo. Finalmente, o equipamento necessário para detecção e geração de imagens - quimioluminescente, fluorescente, radioativo ou sistemas de detecção a laser - pode ser muito caro para uma unidade de microbiologia comum.