O projeto genético de uma célula é codificado em seu material genético, ou DNA. Como o DNA nunca sai do núcleo da célula, para que essa informação entre no citoplasma onde outras residem proteínas e componentes bioquímicos, é necessário primeiro transcrever o DNA em RNA mensageiro (mRNA ou poli (A) RNA). Este mRNA é então traduzido em proteínas que realizam muitas funções da célula. Para detectar ou quantificar mRNAs muito raros, fazer sondas para microarrays ou construir bibliotecas de moléculas de DNA complementar, o mRNA deve ser isolado. No entanto, a extração de RNA total (ou seja, todo o RNA em uma célula) e o subsequente isolamento de mRNA não são processos mutuamente exclusivos; o primeiro deve ser realizado para que o mRNA seja extraído.
Homogeneização de TRIzol: RNA total inclui todo o mRNA, RNA de transferência, RNA ribossômico e outros não codificadores RNAs. Para separar estes de outros componentes celulares, a célula é primeiro aberta para liberar seu conteúdo. Isso é feito ressuspendendo as células peletizadas por centrifugação (girando em altas velocidades) em TRIzol Reagent (Life Technologies). Outras versões do TRIzol (como o reagente TRI da Ambion) funcionam de forma semelhante.
Isolamento de RNA total: uma série de centrifugações é usada para separar os diferentes componentes (proteínas, DNA, RNA) da célula em camadas, ou fases, dentro da suspensão. A fase superior, de cor amarela, é composta por gordura e pode ser descartada. A fase desejada é tingida de vermelho, contém o RNA total e é retida. Após realizar uma extração com fenol-clorofórmio e uma série de lavagens com álcool usando isopropanol e etanol, o RNA pode ser sedimentado para isolamento de mRNA. Adicione inibidores de RNase para evitar que esta enzima degrada o RNA total.
Extração de mRNA: É comum usar um kit para isolar mRNAs, pois os protocolos de laboratório caseiros não geram grandes quantidades de mRNAs altamente purificados. Os kits comerciais incluem o FastTrack 2.0 da Invitrogen ou o isolamento de mRNA puro do Ambion Poly (A) Kit. Essas etapas básicas são comuns a esses kits:
d) Centrifugue esta amostra e recupere o sobrenadante, que é lavado várias vezes em uma série de tampões de ligação e baixo teor de sal fornecidos nos kits.
Referências
- "Protocolos de Biblioteca de cDNA?"; Ian G. Cowell e Caroline A. Austin; 1997
- "In Vitro Transcription and Translation Protocols?"; Martin J. Tymms; 1995
Pontas
- Mantenha todos os reagentes, células e RNA resfriados, mergulhando-os no gelo. Isso evita que o RNA seja degradado por quaisquer outras enzimas que sejam liberadas durante o processo de homogeneização.
Avisos
- Reagentes como o TRIzol são tóxicos e não devem entrar em contato com a pele ou membranas mucosas. Sempre observe os protocolos de laboratório seguros ao manusear este reagente.
Sobre o autor
Palmer Owyoung tem mestrado em negócios internacionais pela Universidade da Califórnia em San Diego e um Bacharel em Sociologia pela Universidade da Califórnia em Santa Bárbara e é um molecular formado biólogo. Ele é escritor freelance desde 2006. Além de escrever, ele é um comerciante de Forex em tempo integral e comerciante da Internet.
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