Ao trabalhar com cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), uma boa calibração é absolutamente essencial para garantir resultados confiáveis e de qualidade. A calibração adequada de um instrumento HPLC começa com a criação de um padrão de calibração adequado. Na maioria dos casos, a calibração de fato requer uma série de padrões de concentração crescente para produzir o que é conhecido como curva de calibração. Esta é uma linha traçada e a equação associada que descreve a relação entre a concentração do produto químico sendo testado e a resposta do detector de HPLC.
Determine o produto químico que deseja testar usando o HPLC (o "analito"). Por exemplo, você pode desejar testar uma série de refrigerantes quanto ao teor de frutose, caso em que a frutose seria o analito.
Obtenha uma quantidade do analito químico de pureza adequada. Normalmente, a pureza deve estar acima de 99% e o analito deve ser adquirido de uma empresa de fornecimento de produtos químicos de boa reputação. No caso da frutose, por exemplo, você compraria frutose pura de um vendedor de produtos químicos e não de um supermercado.
Determine as concentrações máximas e mínimas previstas do analito nas amostras que você pretende testar no HPLC. No caso de refrigerantes, você examinaria os rótulos das bebidas e determinaria o menor e o maior teor de frutose entre as bebidas que testaria. Lembre-se de que a amostra inicial (o refrigerante) pode ser diluída ou manipulada durante a preparação para análise (dependendo do método de HPLC sendo usado) e, portanto, a concentração de analito nas amostras realmente injetadas no HPLC pode ser modificado. É a concentração do analito nas amostras, conforme executado no HPLC, que deve ser considerada.
Determine o solvente no qual você irá dissolver o analito para formar os padrões de calibração. Este solvente deve ser capaz de dissolver adequadamente o analito em uma faixa relativamente ampla de concentração (pelo menos tão alta quanto nas amostras que você pretende testar). Da mesma forma, idealmente, esse solvente deve ser bastante semelhante à "fase móvel": o solvente usado para transportar as amostras pelo instrumento de HPLC.
Calcule a quantidade de analito necessária para fazer uma solução "padrão de estoque" do analito. Isso é encontrado multiplicando a concentração necessária do padrão de estoque pelo volume desejado. A concentração do analito nesta solução deve ser pelo menos 10% maior do que a maior concentração de amostra prevista. Se a maior concentração de frutose prevista em uma amostra de refrigerante for 8 gramas / 100 mililitros, o padrão de estoque poderia ser feito para uma concentração de 10 gramas de frutose / 100 mililitros. Um volume razoável é de 500 mililitros, portanto, 8/100 mL x 500 mL = 40 gramas de frutose seriam necessários.
Pese a quantidade necessária de analito para um nível adequado de precisão. Freqüentemente, um valor de peso em gramas com uma ou duas casas decimais é adequado, mas mais precisão pode ser necessária para alguns métodos.
Transfira o analito pesado para um frasco volumétrico do volume necessário e adicione o solvente desejado à marca de preenchimento do frasco. O uso de um frasco volumétrico (em vez de um copo graduado, por exemplo) aumenta a precisão do valor da concentração do padrão de estoque. Certifique-se de que todo o analito seja transferido para o frasco; use um pouco do solvente para lavá-lo, se necessário.
Faça uma série de diluições variáveis do padrão de estoque, transferindo volumes conhecidos do padrão de estoque em frascos volumétricos, usando pipetas para transferência precisa e, em seguida, adicionando solvente. A concentração padrão mais baixa deve estar abaixo da amostra mais baixa prevista para ser analisada. No exemplo do refrigerante, se a menor concentração de frutose esperada em uma amostra for 2 gramas / 100 mL, então um padrão de 1 grama / 100 mL pode ser feito. Isso seria feito por uma diluição de dez vezes do padrão de estoque. A série padrão deve incluir um total de 5 ou 6 concentrações, portanto, diluições adicionais para produzir padrões de talvez 3, 5 e 8 gramas de frutose / mL seriam necessárias. Agora você tem uma série de soluções padrão para calibrar o HPLC.