A eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) é um método bioquímico de identificação de proteínas em solução. Conforme ilustrado por Mathews et al em "Bioquímica", as amostras de proteínas são carregadas primeiro em "poços" ou orifícios em uma extremidade do bloco de gel de poliacrilamida. Um campo elétrico é então aplicado ao gel. O SDS, adicionado às amostras carregadas, anula a carga natural das proteínas. Por esse motivo, o peso molecular da proteína sozinho determina a velocidade de migração das proteínas à medida que se movem através do gel em direção ao pólo carregado positivamente, observa Bitesize Bio. Várias proteínas na mesma amostra irão, portanto, separar-se umas das outras e migrar para diferentes posições.
Oriente a fotografia do gel. "Top" é a localização dos poços onde as amostras foram adicionadas originalmente. "Fundo" é para onde as amostras migraram e, na maioria das vezes, contém a frente de tinta que indica a frente de migração das amostras. Tanto a esquerda quanto a direita devem conter um "marcador", usado como um guia previsível de peso molecular.
Identifique as amostras para cada pista. Na parte superior, as amostras adicionadas aos poços terão migrado verticalmente em "pistas". Portanto, todas as barras visíveis em uma coluna vertical vieram de uma amostra carregada diretamente acima dela. Use a régua e a caneta para colocar bordas nas pistas se for difícil visualizar as colunas.
Identifique os tamanhos moleculares das bandas na pista do marcador. Os marcadores disponíveis comercialmente vêm com uma imagem do padrão de banda esperado, juntamente com os pesos moleculares de cada banda. As bandas são as "barras" horizontais escuras, que são, na verdade, proteínas coradas incorporadas ao gel.
Desenhe linhas horizontais claras estendendo-se de cada faixa do marcador até a borda oposta do gel. Tenha o cuidado de fazer essas linhas paralelas aos poços e à frente da tinta. Estas linhas indicam onde as proteínas do peso molecular indicado por cada uma das bandas marcadoras estariam localizadas em cada pista. Por exemplo, uma banda na faixa 4 que reside logo abaixo da linha estendida a partir de 25 quilodaltons banda do marcador sugeriria que a banda da pista 4 tem quase, mas não exatamente, 25 kilodaltons no peso.
Identifique cada banda em cada pista com seu peso molecular estimado. Use os marcadores como um guia e estime os valores entre os tamanhos dos marcadores.
Abaixo da fotografia do gel, faça uma lista de "proteínas" para cada pista. Comece declarando o que se sabe sobre cada amostra, como sua origem ou condições. Em seguida, liste o peso molecular estimado de cada banda na pista. As faixas com uma banda indicam que a amostra contém apenas uma proteína. Faixas com várias bandas indicam a presença de várias proteínas. As bandas que correm com a frente de migração são menores do que o sugerido pelo marcador mais próximo e provavelmente não podem ser previstas, exceto como "menores do que" o marcador indica.
Na lista de proteínas, observe as esquisitices. Uma aparência "manchada" pode indicar que muitas proteínas estão presentes ou que a viscosidade da amostra afetou sua migração. Se as bandas parecem ir além do borda da pista ou são muito grandes em comparação com outras bandas, então a concentração dessa proteína é provavelmente muito alta e deve ser diluída no futuro eletroforese. Uma tonalidade acinzentada em toda a pista, mais escura do que a cor do gel de fundo, indica fragmentos de proteína indistinguíveis.
Determine a identidade das proteínas em cada pista. Embora isso seja feito usando apenas o peso molecular, a origem de cada pista provavelmente também indicará pistas. Considere que, sob algumas condições, as proteínas podem manter uma associação de dímero ou trímero em um gel. Portanto, uma proteína pode aparecer em um gel como três bandas distintas. Mesmo que as proteínas não possam ser identificadas, a escuridão relativa das bandas pode implicar nas concentrações das proteínas em solução. Quaisquer proteínas curiosas e desconhecidas podem ser isoladas diretamente do gel original e enviadas para identificação.
Coisas que você precisa
- Fotografia de gel SDS-PAGE, corado
- Chave para o marcador de peso molecular usado
- governante
- Caneta