A cromatografia líquida de alto desempenho é uma técnica para a análise laboratorial de uma mistura. É um tipo eficiente de cromatografia que usa alta pressão, em vez de simplesmente gravidade, para impulsionar uma amostra de uma mistura através de uma coluna. Uma amostra é injetada e, em seguida, uma bomba contendo grandes quantidades de pressão ajuda a mover a amostra ao longo de uma coluna compactada, onde é separada em componentes individuais. Essa separação é então analisada por um detector para produzir resultados.
Local de injeção
Para ser injetada em um HPLC, uma amostra deve primeiro ser dissolvida em um solvente líquido polar, de preferência um com espectros de HPLC conhecidos para que seus dados possam ser distinguidos dos da amostra. A solução líquida contendo a amostra é colocada no instrumento e enviada para a coluna. A localização real do local da injeção depende da marca dos instrumentos. Na maioria dos casos, o processo de injeção é automatizado, mas em alguns casos um trabalhador de laboratório deve injetar a amostra usando uma pequena agulha de seringa.
Componente da bomba
O componente da bomba da unidade de HPLC é necessário porque fornece a pressão que impulsiona a amostra através da coluna. A força da bomba varia, mas uma poderosa pode produzir uma pressão de até 6.000 psi, ou libras por polegada quadrada, que é aplicada depois que a amostra é injetada. Isso permite que a amostra passe pela coluna com mais rapidez e eficiência do que se pingasse usando apenas a força da gravidade.
Descrição da coluna
O aumento da velocidade de uma amostra passada pela coluna por uma bomba permite o uso de um tipo de coluna diferente daqueles usados na cromatografia líquida simples. O material de empacotamento na coluna pode ter um tamanho de partícula muito menor, o que aumenta a área de superfície e, portanto, auxilia as interações da amostra com a coluna. A maioria das colunas HPLC funcionam com polaridade. A amostra é dissolvida em um solvente polar e a coluna é composta em grande parte por hidrocarbonetos não polares. As partes polares da molécula da amostra passam pela coluna muito rapidamente porque estão interagindo principalmente com o solvente, enquanto os componentes não polares da amostra permanecem na coluna, formando interações fracas com a coluna componentes. Portanto, os componentes da amostra saem da coluna em ordem do mais polar para o mais apolar.
Função Detector
Os detectores também variam de acordo com o tipo de instrumento HPLC usado. No entanto, a maioria funciona da mesma maneira básica. Uma fonte de luz ultravioleta brilha nos componentes separados da amostra à medida que eles saem da coluna. A maioria dos compostos orgânicos absorvem uma certa quantidade de luz, portanto, à medida que passam pelo feixe de luz aplicado, um detector pode captar a quantidade de luz absorvida. O detector também registra o tempo de retenção dos componentes com base na ordem em que saem da coluna. Essa saída pode então ser analisada com base na área do pico para determinar a natureza exata dos componentes da amostra.