Reakcja łańcuchowa polimerazy, czyli PCR, to technika polegająca na kopiowaniu jednego fragmentu DNA na wiele fragmentów – wykładniczo wiele. Pierwszym krokiem w PCR jest podgrzanie DNA, aby uległo denaturacji lub stopiło się w pojedyncze nici. Struktura DNA jest jak drabina sznurowa, w której szczeble są linami z magnetycznymi końcami. Magnesy łączą się, tworząc szczeble, zwane parami zasad, dzięki czemu są odporne na rozerwanie. Każdy fragment DNA topi się w pojedyncze nici w różnych temperaturach. Zrozumienie, w jaki sposób struktura DNA jest utrzymywana razem przez poszczególne części DNA, da wgląd w to, dlaczego różne fragmenty DNA topią się w różnych temperaturach i dlaczego tak wysokie temperatury są potrzebne w pierwszym miejsce.
Topienie! Topienie!
Pierwszym etapem PCR jest stopienie DNA tak, aby dwuniciowy DNA rozdzielał się na jednoniciowy DNA. W przypadku DNA ssaków ten pierwszy etap zwykle obejmuje temperaturę około 95 stopni Celsjusza (około 200 Fahrenheita). W tej temperaturze wiązania wodorowe między parami zasad A-T i G-C, czyli szczeble drabiny DNA, rozpadają się, rozpinając dwuniciowy DNA. Jednak temperatura nie jest wystarczająco wysoka, aby złamać szkielet fosforanowo-cukrowy, który tworzy pojedyncze pasma lub bieguny drabiny. Całkowite oddzielenie pojedynczych nici przygotowuje je do drugiego etapu PCR, który polega na chłodzeniu, aby krótkie fragmenty DNA, zwane starterami, mogły związać pojedyncze nici.
Zamki magnetyczne
Jednym z powodów, dla których DNA jest podgrzewane do wysokiej temperatury 95 stopni Celsjusza, jest to, że im dłuższa jest podwójna nić DNA, tym bardziej chce pozostać razem. Długość DNA jest jednym z czynników wpływających na temperaturę topnienia wybraną do PCR na tym kawałku DNA. Pary zasad A-T i G-C w dwuniciowym DNA wiążą się ze sobą, aby utrzymać razem dwuniciową strukturę. Im więcej kolejnych par zasad między dwiema pojedynczymi nićmi zwiąże się, tym bardziej ich sąsiedzi również chcą się związać i tym silniejsze staje się przyciąganie między dwiema nitkami. Jest jak zamek błyskawiczny zrobiony z małych magnesów. Po zamknięciu suwaka magnesy naturalnie będą chciały zapiąć się i pozostać zapiętym.
Silniejsze magnesy trzymają się mocniej
Innym czynnikiem wpływającym na wybór temperatury topnienia dla interesującego fragmentu DNA jest ilość par zasad G-C obecnych w tym fragmencie. Każda para baz jest jak dwa przyciągające się minimagnesy. Para złożona z G i C jest znacznie silniej przyciągana niż para A i T. Zatem fragment DNA, który ma więcej par G-C niż inny fragment, będzie wymagał wyższej temperatury przed stopieniem się w pojedyncze nici. DNA w naturalny sposób absorbuje światło ultrafioletowe – dokładnie o długości fali 260 nanometrów – a jednoniciowy DNA absorbuje więcej światła niż dwuniciowy DNA. Zatem mierzenie ilości zaabsorbowanego światła jest sposobem mierzenia, jak bardzo twoje dwuniciowe DNA stopiło się w pojedyncze nici. Efekt „magnetycznego zamka” par zasad G-C i AT jest tym, co powoduje wykres absorbancji światła dwuniciowy DNA wykreślony w funkcji wzrostu temperatury jest sigmoidalny, w kształcie litery S, a nie linia prosta. Krzywa S reprezentuje opór pracy zespołowej, jaki pary zasad wywierają na ciepło, ponieważ nie chcą się rozdzielać.
Półmetek
Temperatura, w której odcinek DNA topi się w pojedyncze nici, nazywana jest jego temperaturą topnienia, oznaczoną skrótem „Tm”. Wskazuje to temperaturę, w której połowa DNA w roztworze stopiła się w pojedyncze nici, a druga połowa jest nadal w postaci podwójnej Formularz. Temperatura topnienia jest inna dla każdego fragmentu DNA. DNA ssaków zawiera 40% G-C, co oznacza, że pozostałe 60% par zasad to As i Ts. Jego 40% zawartość G-C powoduje, że DNA ssaków topi się w temperaturze 87 stopni Celsjusza (około 189 Fahrenheita). Dlatego pierwszym krokiem PCR na DNA ssaków jest podgrzanie go do 94 stopni Celsjusza (201 Fahrenheita). Tylko siedem stopni cieplej niż temperatura topnienia, a wszystkie podwójne nici całkowicie stopią się w pojedyncze pasma.