Błony komórkowe składają się z fosfolipidów i przyłączonych lub osadzonych białek. Białka błonowe odgrywają istotną rolę w metabolizmie i życiu komórki. Nie można użyć zwykłej mikroskopii do wizualizacji lub scharakteryzowania białek adhezyjnych, białek transportowych i kanałów białkowych w błonie komórkowej. Stosując mikroskopię elektronową i technikę zwaną „zamarzniętym pęknięciem”, która rozdziela zamrożone błony komórkowe, umożliwia wizualizację struktury błony i organizacji białek w morzu fosfolipidy. Połączenie innych metod ze szczelinowaniem przez zamrażanie nie tylko pomaga nam zrozumieć strukturę różnych błon komórkowych i białek błonowych, ale pozwala na wizualizację i szczegółową analizę funkcji określonych białek, bakterii i wirusy.
Podstawowe kroki w zamrażaniu złamania
Przy użyciu ciekłego azotu próbki tkanek biologicznych lub komórki są szybko zamrażane w celu unieruchomienia składników komórek. Błony komórkowe składają się z dwóch warstw fosfolipidów, zwanych dwuwarstwą, gdzie hydrofobowe lub nienawidzące wody ogony lipidowe wskazują na wnętrze błony i hydrofilowe lub kochające wodę końce cząsteczki lipidu są skierowane na zewnątrz i do wewnątrz komórka. Zamrożona próbka jest pękana lub łamana za pomocą mikrotomu, który jest podobnym do noża narzędziem do cięcia cienkich plastrów tkanki. To powoduje, że błona komórkowa rozdziela się dokładnie między dwie warstwy, ponieważ przyciąganie między hydrofobowymi ogonami lipidowymi stanowi najsłabszy punkt. Po szczelinowaniu próbka poddawana jest procedurze próżniowej zwanej „trawieniem zamrażającym”. Powierzchnia złamania próbka jest cieniowana oparami węgla i platyny, aby uzyskać stabilną replikę, która podąża za konturami pęknięcia samolot. Kwas jest używany do trawienia materiału organicznego przylegającego do repliki, pozostawiając cienką platynową powłokę na pękniętej powierzchni membrany. Powłoka ta jest następnie analizowana pod mikroskopem elektronowym.
Wytrawianie zamrażające
Liofilizacja to suszenie próżniowe nieutrwalonej, zamrożonej i liofilizowanej próbki biologicznej. Procedura suszenia próżniowego jest podobna do liofilizacji owoców i warzyw, które są pakowane i sprzedawane w sklepach spożywczych. Bez wytrawiania zamrażalniczego wiele szczegółów struktury komórkowej jest przesłanianych przez kryształki lodu. Etap głębokiego lub zamrażania trawienia poprawia i rozszerza pierwotną metodę zamrażania pękania, umożliwiając obserwację błon komórkowych podczas różnych czynności. Pozwala na analizę nie tylko struktury błony, ale również składników wewnątrzkomórkowych i dostarcza szczegółowych informacji strukturalnych na temat bakterii, wirusów i dużych białek komórkowych kompleksy.
Mikroskopia elektronowa
Mikroskopia elektronowa może ujawnić i powiększyć ponad milion razy najmniejsze organizmy lub struktury, takie jak bakterie, wirusy, składniki wewnątrzkomórkowe, a nawet białka. Wizualizacja powstaje poprzez bombardowanie ultracienkiej próbki wiązką elektronów. Dwie metody mikroskopii elektronowej to skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM). Zamrożone próbki złamań są rutynowo analizowane za pomocą TEM. TEM ma lepszą rozdzielczość niż SEM i oferuje informacje strukturalne do 3 nanometrów replik.
Ujawnienie struktury błony komórkowej
Opracowanie i zastosowanie mikroskopii elektronowej z zamrożeniem złamań wykazało, że błony plazmatyczne komórek składają się z dwuwarstw lipidowych i wyjaśniły, w jaki sposób białka są zorganizowane w błonach komórkowych. Złamanie zamrażające daje wyjątkowy wygląd wnętrza błon komórkowych, ponieważ dzieli i oddziela fosfolipidy błonowe na dwie przeciwne i dopełniające się warstwy lub powierzchnie. W ciągu ponad 50 lat od wprowadzenia pierwszej maszyny do łamania metodą zamrażania, wykonanie platynowej repliki jest nadal jedynym sposobem na uzyskanie informacji strukturalnych o błonie komórkowej. Technika pokazuje, czy określone białka unoszą się lub są zakotwiczone w błonie komórkowej oraz czy i jak niektóre białka agregują. Nowsza metoda – wykorzystująca przeciwciała, które celują w określone białka – jest połączona z łamaniem zamrażania w celu identyfikacji białek i ich funkcji w błonie komórkowej.
