Western blot, technika analityczna stosowana do wskazania konkretnego białka w danej próbce, wykorzystuje zdolność enzymu lub znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała pierwotnego do wiązania się z jego specyficznym antygenem. Jest to trzyetapowy proces rozpoczynający się od elektroforezy żelowej, po którym następuje blotting membranowy i sondowanie przeciwciałami. Wykrywanie białka może być bezpośrednie lub pośrednie, przy czym to drugie wykorzystuje znakowane drugorzędowe przeciwciało skierowane przeciwko pierwszorzędowemu. Chociaż akceptowana jako rutynowa technika analizy białek, Western blot ma ograniczenia, a także korzyści.
Zaletą: Czułość
Jednym z największych argumentów przemawiających za western blot jest jego wrażliwość. Ze względu na zdolność wykrywania zaledwie 0,1 nanograma białka w próbce technika ta może teoretycznie służyć jako skuteczne narzędzie wczesnej diagnostyki, wykrywające nawet najmniejszą odpowiedź immunogenną wirusa lub bakterii u pacjenta próba. Pośrednia analiza Western blot dodatkowo opiera się na tej czułości ze zdolności przeciwciała drugorzędowego do wzmacniania intensywności sygnału wykrytego przez system obrazowania. Większa czułość oznacza, że do testowania potrzeba mniej przeciwciał, co znacznie obniża koszty laboratorium.
Zaletą: Specyfika
Technika western blot swoją specyfikę zawdzięcza dwóm istotnym czynnikom. Po pierwsze, elektroforeza żelowa sortuje próbkę na białka o różnej wielkości, ładunku i konformacji. Ten proces sam w sobie jest ogromnym krokiem w kierunku wykrywania, ponieważ prążki utworzone w żelu już dają wskazówki dotyczące wielkości białka lub polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. Specyficzność interakcji przeciwciało-antygen służy jako drugi ważny czynnik. Ponieważ specyficzne przeciwciała wykazują powinowactwo do określonych białek, proces może selektywnie wykryć docelowe białko nawet w mieszaninie 300 000 różnych białek.
Wada: skłonność do fałszywych lub subiektywnych wyników
Pomimo swojej czułości i swoistości, Western blot może nadal dawać błędne wyniki. Fałszywie dodatnie wyniki, gdy przeciwciało reaguje z niezamierzonym białkiem, co często zdarza się dzieje się tak, gdy pacjent badany na obecność wirusa HIV ma gruźlicę lub szereg pasożytów infekcje. Z drugiej strony wynik fałszywie ujemny może łatwo wystąpić, jeśli większe białka nie mają wystarczającej ilości czasu na prawidłowe przeniesienie do błony. Niewłaściwe blotting i przetwarzanie często skutkują przekrzywionymi, wyblakłymi lub nawet wieloma paskami, co sprawia, że wyniki testu podlegają interpretacji technika.
Wada: wysokie koszty i zapotrzebowanie techniczne
Koszt Western blot jest sumą dużych indywidualnych wydatków na znakowane przeciwciała, wykwalifikowanych analityków i sprzęt laboratoryjny. Delikatny proces, Western blot, wymaga precyzji na każdym etapie w celu prawidłowej identyfikacji składników próbki. Niewielki błąd w stężeniu odczynnika lub w okresie inkubacji może być katastrofalny dla całego procesu. Wreszcie sprzęt wymagany do wykrywania i obrazowania — systemy wykrywania chemiluminescencyjnego, fluorescencyjnego, radioaktywnego lub laserowego — może być zbyt drogi dla przeciętnej jednostki mikrobiologicznej.
