Spektrofotometria to nieocenione narzędzie w chemii i biologii. Podstawowa idea jest prosta: różne substancje lepiej absorbują światło/promieniowanie elektromagnetyczne przy niektórych długościach fal niż przy innych. Dlatego niektóre materiały są przezroczyste, podczas gdy inne są na przykład kolorowe. Kiedy przepuszczasz przez roztwór światło o danej długości fali, im wyższe jego stężenie, tym więcej światła pochłonie. Aby obliczyć stężenie, musisz porównać swój odczyt z odczytami dla standardów o znanym stężeniu. Poniższa procedura jest dość ogólną procedurą napisaną z myślą o laboratorium nauczania chemii, ale można ją również zmodyfikować dla innych ustawień.
Jak zawsze podczas pracy w laboratorium, załóż gogle, rękawiczki i płaszcz z długimi rękawami, aby zapewnić sobie bezpieczeństwo.
Ściśnij gumową bańkę, aby opróżnić ją z powietrza, a następnie umieść ją na pipecie z podziałką i pozwól bańce się rozluźnić, aby zassała wodę do pipety. Następnie wyjmij bańkę i zakryj palcem górną część pipety; zamknie to pipetę, tak aby roztwór wewnątrz nie wypłynął, dopóki palec nie zostanie usunięty. Lekko unieś krawędź palca, aby z pipety wypłynęła niewielka ilość roztworu, aż do uzyskania pożądanej objętości. Poćwicz z wodą i zlewką, aby poczuć, jak działa pipeta z podziałką. Link w sekcji Zasoby zawiera klip filmowy, który pokazuje, jak używać pipety, jeśli nigdy wcześniej z nią nie pracowałeś.
Oznacz 5 probówek jako standardy 1-5. Możesz je opisać za pomocą taśmy maskującej i długopisu lub używając suchościeralnego markera.
Wybierz pięć stężeń dla swoich standardów. Chcesz, aby standardowe stężenia były oddzielone od siebie o mniej więcej ten sam przedział – np. 0,1 molowe, 0,2 molowe, 0,3 molowe itd. -- i mniej więcej w tym samym zakresie, w jakim oczekujesz, że będzie twoja niewiadoma. Na razie użyj następujących pięciu stężeń, ale pamiętaj, że będziesz musiał je zmodyfikować podczas wykonywania własnego eksperymentu:
Standard 1: 0,1 mola Standard 2: 0,2 mola Standard 3: 0,3 mola Standard 4: 0,4 mola Standard 5: 0,5 mola
Następnie weź 1 molowy roztwór wzorcowy i dodaj następujące ilości do probówek 1-5. Pamiętaj, że te ilości są obliczane przy użyciu stężeń wymienionych powyżej, więc podczas wykonywania własnego eksperymentu może być konieczne ich zmodyfikowanie.
Standard 1: 0,8 mililitrów Standard 2: 1,6 mililitrów Standard 3: 2,4 mililitrów Standard 4: 3,2 mililitrów Standard 5: 4 mililitry
Wypłucz pipetę z podziałką, a następnie przenieś następujące ilości wody dejonizowanej:
Standard 1: 7,2 mililitrów Standard 2: 6,4 mililitrów Standard 3: 5,6 mililitrów Standard 4: 4,8 mililitrów Standard 5: 4,0 mililitry
Zasadniczo chodzi o doprowadzenie ilości roztworu w każdej probówce do 8 mililitrów.
Zakryj każdą probówkę wzorcową parafilmem i odwróć je, aby wymieszać.
Oznacz kolejne pięć probówek jako „Nieznane 1-5”. Do każdego z nich dodaj te same ilości nieznanego lub testowanego roztworu, jak w przypadku 1-molowego roztworu wzorców. Innymi słowy, nieznana 1 będzie zawierała 0,8 mililitrów roztworu testowego i 7,2 mililitrów woda, nieznana 2 będzie zawierała 1,6 mililitrów roztworu testowego i 6,4 mililitrów wody, i tak naprzód.
Zakryj każdą niewiadomą parafilmem i ostrożnie odwróć, aby wymieszać.
Włącz spektrofotometr i pozwól mu się rozgrzać. Niezbędny czas zależy od modelu i producenta.
Ustaw długość fali na spektrofotometrze. Długość fali będzie zależeć od rodzaju substancji chemicznej w twoim eksperymencie. Na razie przyjmij 500 nm, pamiętaj jednak, że będziesz musiał to zmienić dla różnych eksperymentów.
Skalibruj swój spektrofotometr. Procedura kalibracji będzie się różnić w zależności od używanego urządzenia. W przypadku Spectronic 20, popularnego modelu w laboratoriach dydaktycznych, najpierw ustaw maszynę tak, aby wyświetlała „0 procent T” gdy żadna kuweta nie jest załadowana, wyreguluj ją tak, aby wyświetlała „100% T”, gdy pusta kuweta zawierająca tylko wodę dejonizowaną jest załadowany. Procedury te mogą się różnić w zależności od rodzaju używanej maszyny, dlatego należy zapoznać się z instrukcjami producenta, aby uzyskać szczegółowe informacje.
Po skalibrowaniu urządzenia weź standardową 1 probówkę i wlej zawartość do czystej kuwety, aż osiągną linię napełnienia. Przetrzyj kuwetę chusteczką kimwipe, aby usunąć wszelkie odciski palców lub inne zabrudzenia. Włóż kuwetę do spektrofotometru i zapisz odczyt „%T”.
Powtórz tę procedurę dla wszystkich 10 próbek. NA PEWNO czyścić kuwetę między próbkami, aby upewnić się, że wyniki są jak najdokładniejsze.
Weź wyniki dla swoich standardów i wprowadź je do arkusza kalkulacyjnego/programu graficznego, takiego jak Excel lub OpenOffice.
Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, podziel 100 procent przez każdą z wartości „%T” dla standardów, a następnie weź dziennik wyniku. To obliczenie da ci absorbancję. Jeśli wprowadzisz formułę, program do obsługi arkuszy kalkulacyjnych wykona za Ciebie obliczenia.
Przykład: Jeśli %T wynosi 50,6, formuła, którą wprowadzisz do arkusza kalkulacyjnego, będzie następująca:
log (100 / 50,6)
Program arkusza kalkulacyjnego wykona arytmetykę.
Zrób to samo dla wszystkich pięciu nieznanych/eksperymentalnych wartości.
Wykreśl wartości absorbancji dla wszystkich pięciu standardów, ze stężeniem na osi x i absorbancją na osi y. Korzystając z programu do arkuszy kalkulacyjnych, dopasuj równanie liniowe do tego wykresu. Równanie będzie miało postać y = mx + b. Większość programów do arkuszy kalkulacyjnych posiada funkcję regresji liniowej. Zapoznaj się z instrukcją obsługi programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z funkcji regresji liniowej.
Weź równanie dla najlepiej dopasowanej linii z programu arkusza kalkulacyjnego i rozwiąż je dla y, odejmując b od obu stron i dzieląc obie strony przez m. Wynik będzie wyglądał następująco:
(y - b)/m = x
gdzie b i m to wartości znalezione przez program arkusza kalkulacyjnego.
Sprawdź swoje wartości absorbancji pod kątem niewiadomych i wybierz trzy, które mieszczą się w tym samym zakresie co standardy. Użyj tych trzech wartości absorbancji do pozostałych obliczeń. Jeśli wszystkie pięć mieszczą się w tym samym zakresie, co standardy, możesz zamiast tego użyć wszystkich pięciu, ale musisz użyć co najmniej trzech.
Wstaw każdą z trzech wartości absorbancji do swojego równania w miejsce y. Pamiętaj, że twoje równanie miało następującą postać:
(y - b)/m = x
Więc będziesz chciał wstawić wartość absorbancji dla każdej nieznanej do równania w miejsce y, a następnie obliczyć x. Możesz użyć programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby wykonać te obliczenia i przyspieszyć je. Obliczyłeś teraz stężenie badanej substancji chemicznej w trzech z twoich rozcieńczonych niewiadomych. Oryginalny roztwór został jednak rozcieńczony, aby przygotować te niewiadome, więc teraz musisz cofnąć się i obliczyć stężenie oryginalnego roztworu na podstawie współczynnika rozcieńczenia.
Każda nieznana próbka włożona do spektrofotometru została rozcieńczona w innej ilości. W związku z tym należy teraz podzielić stężenie obliczone na podstawie absorbancji dla każdego nieznanego odczytu przez:
Nieznane 1: Podziel przez 0,1 Nieznane 2: Podziel przez 0,2 Nieznane 3: Podziel przez 0,3 Nieznane 4: Podziel przez 0,4 Nieznane 5: Podziel przez 0,5
Pamiętaj jednak, że te liczby opierają się na założeniu, że używasz rozcieńczeń przedstawionych powyżej. Pamiętaj, aby zmienić te wartości, jeśli rozcieńczyłeś próbki o inną ilość.
Zsumuj swoje wyniki i podziel je przez liczbę wyników. To da ci średnią. Podaj tę liczbę jako swoje odkrycie dotyczące stężenia oryginalnego roztworu.
Rzeczy, których będziesz potrzebować
- Ołówek
- Papier
- Kalkulator
- Rękawiczki
- Okulary ochronne
- Płaszcz z długimi rękawami
- Spektrofotometr
- Kuwety szklane
- Parafilm
- Kimwipe
- Dejonizowana woda
- Roztwór, który chcesz przetestować (o nieznanym stężeniu)
- 1 molowy roztwór wzorcowy substancji chemicznej obecnej w roztworze testowym
- Pipeta z podziałką i gruszka
- Probówki i stojak na probówki
- Zlewka
Wskazówki
Ta procedura może wydawać się skomplikowana, ale po rozpoczęciu jest dość prosta. Spróbuj obejrzeć dwa filmy w sekcji Zasoby, aby zapoznać się z procedurą.