Elektroforeza w żelu siarczanu dodecylu sodu-poliakryloamidu (SDS-PAGE) to biochemiczna metoda identyfikacji białek w roztworze. Jak zilustrowali Mathews i in. w „Biochemistry”, próbki białek są najpierw ładowane do „studzienek” lub otworów na jednym końcu bloku żelowego poliakryloamidowego. Następnie na żel przykłada się pole elektryczne. SDS dodany do załadowanych próbek neguje naturalny ładunek białek. Z tego powodu sama masa cząsteczkowa białka określa prędkość migracji białek, gdy przemieszczają się one w żelu w kierunku dodatnio naładowanego bieguna, zauważa Bitesize Bio. Wiele białek w tej samej próbce będzie zatem oddzielać się od siebie i migrować do różnych pozycji.
Zorientuj zdjęcie żelu. „Góra” to lokalizacja dołków, do których pierwotnie dodano próbki. „Dół” to miejsce, w którym próbki migrowały w kierunku i najczęściej zawiera front barwnika, który wskazuje migrujący front próbek. Lewa lub prawa strona powinna zawierać „marker” używany jako przewidywalny wskaźnik masy cząsteczkowej.
Oznacz próbki dla każdej linii. U góry próbki dodane do dołków będą migrować pionowo „pasami”. Dlatego wszystkie słupki widoczne w pionowej kolumnie pochodziły z jednej próbki załadowanej bezpośrednio nad nią. Użyj linijki i pióra, aby umieścić obramowania na pasach, jeśli trudno jest zwizualizować kolumny.
Oznacz rozmiary cząsteczek prążków w ścieżce znacznikowej. Dostępne w handlu markery zawierają obraz oczekiwanego wzoru prążków wraz z masą cząsteczkową każdego prążka. Pasma to ciemne, poziome „paski”, które w rzeczywistości są wybarwionym białkiem osadzonym w żelu.
Narysuj jasne poziome linie rozciągające się od każdego znacznika do przeciwległej krawędzi żelu. Uważaj, aby te linie były równoległe do dołków i do czoła barwnika. Linie te wskazują, gdzie białka o masie cząsteczkowej wskazanej przez każdy z prążków markerowych byłyby zlokalizowane na każdej linii. Na przykład pasmo na pasie 4, które znajduje się tuż pod linią przedłużoną z 25-kilodalton pasmo znacznikowe sugerowałoby, że pasmo 4 to prawie, ale nie całkiem 25 kilodaltonów molekularnie waga.
Oznacz każdy prążek w każdej ścieżce jego szacowaną masą cząsteczkową. Użyj znaczników jako wskazówek i oszacuj wartości między rozmiarami znaczników.
Poniżej zdjęcia żelu zrób listę „białek” dla każdej linii. Zacznij od określenia, co wiadomo o każdej próbce, np. jej pochodzeniu lub warunkach. Następnie wypisz szacowaną masę cząsteczkową każdego prążka na ścieżce. Ścieżki z jednym prążkiem wskazują, że próbka zawiera tylko jedno białko. Ścieżki z wieloma prążkami wskazują na obecność wielu białek. Prążki biegnące z frontem migracji są mniejsze niż sugerowane przez najbliższy znacznik i prawdopodobnie nie można ich przewidzieć, chyba że są „mniejsze niż” wskazuje znacznik.
Na liście białek zwróć uwagę na osobliwości. „Rozmazany” wygląd może wskazywać, że występuje zbyt wiele białek lub że lepkość próbki wpłynęła na jej migrację Jeśli prążki wydają się wykraczać poza krawędzi pasa lub są dość duże w porównaniu z innymi pasmami, wówczas stężenie tego białka jest prawdopodobnie zbyt wysokie i powinno zostać rozcieńczone w przyszłości elektroforeza. Szarawy odcień na całej ścieżce, ciemniejszy niż kolor tła żelu, wskazuje na nie do odróżnienia fragmenty białka.
Określ tożsamość białek na każdej linii. Chociaż odbywa się to przy użyciu tylko masy cząsteczkowej, źródło każdej linii prawdopodobnie również wskaże wskazówki. Weź pod uwagę, że w pewnych warunkach białka mogą utrzymywać asocjację dimeru lub trimeru na żelu. Dlatego jedno białko może pojawić się na żelu jako trzy różne pasma. Nawet jeśli nie można zidentyfikować białek, względna ciemność prążków może sugerować stężenie białek w roztworze. Wszelkie ciekawe i nieznane białka można wyizolować bezpośrednio z oryginalnego żelu i wysłać do identyfikacji.
Rzeczy, których będziesz potrzebować
- Zdjęcie żelu SDS-PAGE, barwionego
- Klucz do używanego markera masy cząsteczkowej
- Linijka
- Długopis