Polymerasekjedereaksjon, eller PCR, er en teknikk som kopierer ett DNA-fragment i mange fragmenter - eksponentielt mange. Det første trinnet er i PCR er å varme opp DNA slik at det denaturerer, eller smelter i enkle tråder. DNA-strukturen er som en taustige der trinnene er tauverk med magnetiske ender. Magnetene kobles sammen for å danne trinnene, kalt basepar, og motstår dermed å bli trukket fra hverandre. Hvert fragment av DNA smelter i enkle tråder ved forskjellige temperaturer. Å forstå hvordan strukturen til DNA holdes sammen av DNAs individuelle deler, vil gi innsikt i hvorfor forskjellige DNA-fragmenter smelter ved forskjellige temperaturer og hvorfor det er nødvendig med så høye temperaturer i den første plass.
Smelting! Smelting!
Det første trinnet med PCR er å smelte DNA slik at dobbeltstrenget DNA skilles i enkeltstrenget DNA. For pattedyrs DNA involverer dette første trinnet vanligvis varme på omtrent 95 grader Celcius (ca. 200 Fahrenheit). Ved denne temperaturen brytes hydrogenbindingen mellom AT- og GC-baseparene, eller trinn i DNA-stigen, fra hverandre og løsner dobbeltstrenget DNA. Imidlertid er temperaturen ikke varm nok til å bryte fosfat-sukker ryggraden som danner de enkelte strengene, eller stolpene på stigen. Fullstendig separasjon av enkeltstrenger forbereder dem på det andre trinnet i PCR, som er avkjøling for å tillate korte DNA-fragmenter, kalt primere, å binde enkeltstrengene.
Magnetiske glidelåser
En grunn til at DNA blir oppvarmet til den høye temperaturen på 95 grader Celsius, er at jo lenger DNA-dobbeltstrengen er, jo mer vil den være sammen. DNA-lengde er en faktor som påvirker smeltepunktet som er valgt for PCR på den delen av DNA. A-T og G-C baseparene i den dobbeltstrengede DNA-bindingen med hverandre for å holde dobbeltstrengstrukturen sammen. Jo flere sammenhengende basepar mellom to enkeltstrenger har bundet seg, jo mer vil også naboene binde seg, og jo sterkere blir tiltrekningen mellom de to trådene. Det er som en glidelås laget av små magneter. Når du lukker glidelåsen, vil magnetene naturligvis ønske å glidelås og holde seg glidelås.
Sterkere magneter holder seg tettere
En annen faktor som påvirker hvilken smeltetemperatur du vil velge for ditt DNA-fragment av interesse, er mengden GC-basepar som er tilstede i det fragmentet. Hvert basepar er som to mini-magneter som tiltrekker seg. Et par laget av G og C tiltrekkes mye sterkere enn et A og T par. Dermed vil et stykke DNA som har flere GC-par enn et annet fragment kreve høyere temperatur før det smelter i enkle tråder. DNA absorberer naturlig ultrafiolett lys - for å være nøyaktig på 260 nanometer bølgelengde - og enkeltstrenget DNA absorberer mer lys enn dobbeltstrenget DNA. Så å måle mengden absorbert lys er en måte å måle hvor mye ditt dobbeltstrengede DNA har smeltet til enkeltstrenger. Den "magnetiske glidelåsen" -effekten av GC- og AT-basepar er det som forårsaker en graf over lysabsorbansen til dobbeltstrenget DNA plottet mot en økning i temperaturen for å være sigmoidal, formet som en S, og ikke en rett linje. S-kurven representerer teamarbeidsmotstanden som baseparene utøver mot varmen fordi de ikke vil skille seg.
Halfway Point
Temperaturen der en lengde på DNA smelter i enkle tråder kalles dens smeltetemperatur, som er betegnet med forkortelsen "Tm." Dette indikerer temperaturen der halvparten av DNA i en løsning har smeltet til enkeltstrenger og den andre halvparten fortsatt er i dobbeltstreng skjema. Smeltetemperaturen er forskjellig for hvert fragment av DNA. Pattedyr-DNA har et GC-innhold på 40%, noe som betyr at de resterende 60% av baseparene er As og Ts. Dens 40% G-C innhold får DNA fra pattedyr til å smelte ved 87 grader Celsius (ca. 189 Fahrenheit). Dette er grunnen til at det første trinnet av PCR på DNA fra pattedyr er å varme det opp til 94 grader Celsius (201 Fahrenheit). Bare syv grader varmere enn smeltetemperaturen, og alle doble tråder vil helt smelte til enkle tråder.